Antienvelhecimento/Longevidade -
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Antienvelhecimento/Longevidade

Deleções do DNA mitocondrial no envelhecimento: efeito da disfunção na fosforilação oxidativa

16/03/2004

ARTIGO ORIGINAL

 

Célia H. Tengan1, Alberto A. Gabbai1, Carlos T. Moraes2

 


RESUMO
Acredita-se que o acúmulo de deleções do DNA mitocondrial (DNAmt) no envelhecimento seja devido a lesão por radicais livres. Advoga-se que um ciclo vicioso estaria envolvido: lesão do DNAmt ®defeito na cadeia respiratória ®produção de radicais livres®lesão do DNAmt. Se este ciclo é um fator importante, pacientes com deficiência da função oxidativa apresentariam um acúmulo acelerado dessas deleções. Testamos esta hipótese através de três análises: (a) comparação dos níveis de uma deleção específica, deleção comum (DC), em controles normais e pacientes com mitocondriopatia por mutação do DNAmt; (b) análise da co-segregação da DC com uma mutação de ponto patogênica do DNAmt; (c) detecção de deleções múltiplas por PCR (polymerase chain reaction) longo em controles e pacientes com mitocondriopatias. Observamos uma correlação positiva entre a idade e níveis de DC em controles e pacientes. As inclinações das curvas eram semelhantes sugerindo que a taxa de acúmulo da DC era a mesma nos dois grupos. Não observamos a co-segregação do DNAmt contendo a mutação de ponto com a DC nem maior número de deleções em pacientes. Nossos resultados não apoiam a hipótese do ciclo vicioso como fator importante no acúmulo de deleções do DNAmt no envelhecimento.


Unitermos: Envelhecimento; DNA mitocondrial; Mitocondria; Radicais livres.

 


INTRODUÇÃO

As alterações do DNA mitocondrial (DNAmt) foram descritas primariamente em um grupo de doenças conhecido como encefalomiopatias mitocondriais. Embora essas anormalidades (deleções, duplicações, mutações de ponto e depleções) tenham sido associadas a várias síndromes clínicas, desde oftalmoplegia até doenças multi-sistêmicas, pequenas quantidades de deleções do DNAmt também foram encontradas em tecidos envelhecidos normais (Cortopassi & Arnheim, 1990; Corral-Debrinski et al, 1992). A deleção do DNAmt mais freqüentemente estudada no envelhecimento humano é a deleção de 4,9kb denominada de "deleção comum" (DC) devido à sua prevalência na população de pacientes (Moraes et al, 1989; Schon et al, 1989), mas outras deleções também podem se acumular durante o envelhecimento (Torii et al, 1992). Ao contrário do que ocorre nas doenças mitocondriais, a DC é encontrada em pequenas proporções durante o envelhecimento normal, sendo somente detectada através de PCR (polymerase chain reaction) (Cortopassi & Arnheim, 1990; Corral-Debrinski et al, 1992; Torii et al, 1992; Lee et al, 1994; Soong et al, 1992).

Os mecanismos para o acúmulo das deleções do DNAmt no processo de envelhecimento ainda são desconhecidos, mas o mecanismo mais aceito é o de um erro no pareamento de bases durante a replicação do DNAmt (Schon et al, 1989; Schoffner et al, 1990). A lesão oxidativa do DNAmt também aumenta com a idade, sugerindo que estes dois mecanismos possam estar associados na gênese das deleções do envelhecimento. Características peculiares do DNAmt favorecem a lesão por radicais livres: localização próxima da cadeia respiratória, que é uma fonte de radicais livres na mitocôndria, ausência de histonas e sistema de reparo pobre (Clayton, 1982). A cadeia respiratória é composta de quatro complexos enzimáticos multipolipeptídicos: Complexo I (NADH-ubiquinona oxidorredutase), Complexo II (succinato-ubiquinona oxidorredutase), Complexo III (ubiquinol-citocromo c redutase) e Complexo IV (citocromo c oxidase), e dois carreadores de elétrons (ubiquinona e citocromo c). A cadeia respiratória oxida elétrons do NADH ou FADH2 e utiliza a energia para bombear prótons para fora da matriz mitocondrial. A cadeia respiratória mitocondrial normalmente libera pequenas quantidades de superóxidos e peróxido de hidrogênio (H2O2) através da auto-oxidação de uma ou mais espécies de flavina reduzidas, complexo ferro-enxofre e ubiquinona gerados por succinato, NADH e outras ubiquinonas que reduzem desidrogenases.

A hipótese de Bandy & Davison (1990) sugere que a lesão do genoma mitocondrial, causando mutações ou deleções dos produtos genéticos mitocondriais, levaria a um aumento na concentração dos intermediários reduzidos da cadeia respiratória levando à formação de radicais livres através da sua auto-oxidação. De acordo com esta hipótese, um distúrbio no fluxo de elétrons na cadeia respiratória provocaria um escape de elétrons, resultando em um aumento na geração de radicais livres. Esta idéia é reforçada pela demonstração de que a inibição da citocromoxidase ou da oxidação do citocromo b estimularia a geração de H2O2 e superóxidos pela mitocôndria em insetos (Sohal, 1993). Baseado nessas observações, propôs-se um ciclo vicioso: lesão do DNAmt afetaria a função da cadeia respiratória, levando à geração de mais radicais livres que, por sua vez, provocariam lesão adicional ao DNAmt, incluindo deleções do DNAmt (Hayakawa et al, 1993; Nagley et al, 1993).

Estudos bioquímicos de músculo esquelético de pacientes com doenças mitocondriais demonstraram atividade diminuída dos complexos da cadeia respiratória codificados pelo DNAmt (complexos I, III, IV) (Moraes et al, 1989; Shoffner et al, 1990; Moraes et al, 1993; Morgan-Hughes et al, 1995). A biópsia de músculo mostra uma diminuição da atividade do citocromo c oxidase (COX) em pacientes com miopatia mitocondrial decorrente de defeitos no DNAmt (DiMauro et al, 1994). Se o ciclo vicioso descrito acima é um importante fator na geração das deleções do DNAmt no envelhecimento, poderíamos esperar que os pacientes com uma mutação patogênica do DNAmt acumulariam deleções do envelhecimento de maneira mais acelerada que indivíduos normais.

 


OBJETIVO

Este estudo tem como objetivo avaliar o efeito de uma mutação patogênica do DNAmt, levando a uma deficiência na fosforilação oxidativa, na produção de deleções do DNAmt no envelhecimento.

Para isso tentaremos responder a três perguntas:

1. Pacientes com uma mutação patogênica do DNAmt acumulam uma deleção do DNAmt de maneira mais acelerada que indivíduos normais no processo de envelhecimento?
2. Nos pacientes com uma mutação patogênica do DNAmt, quais são as moléculas de DNAmt que mais apresentam a deleção associada com o envelhecimento: o DNAmt normal ou o DNAmt mutado? Considerando-se que as fibras deficientes em COX apresentam mitocôndrias repletas de DNAmt mutado, se o ciclo vicioso realmente ocorre e é um fator importante na geração das deleções no envelhecimento, espera-se que as moléculas de DNAmt mutado sejam mais susceptíveis a essas deleções.
3. Pacientes com uma mutação patogênica do DNAmt apresentam maior variedade de deleções do DNAmt associadas com o envelhecimento?

 

 


MATERIAL E MÉTODOS

Foram realizados três tipos de análises:

1. comparação da quantidade de deleção comum do DNAmt em controles normais e pacientes com doenças mitocondriais geneticamente caracterizadas, e que não apresentam a deleção comum como causadora da doença;
2. análise da segregação da deleção comum associada ao envelhecimento com mutações de ponto patogênicas do DNAmt;
3. detecção de deleções múltiplas do DNAmt por PCR longo em controles e pacientes com desordens mitocondriais

Amostras de DNA

O DNA total foi isolado por extração orgânica a partir de músculo esquelético. As amostras de músculo foram obtidas de casos de necrópsia e de biópsias de pacientes com defeitos do DNAmt e disfunção da fosforilação oxidativa.

Análise quantitativa da deleção comum do DNAmt

Esta análise foi realizada como descrito previamente (Corral-Debrinski, 1991; DiDonato et al, 1993) com pequenas modificações nas condições de amplificação por PCR. Um a 3 µg de DNA total foi digerido com HindIII e PstI. Um microlitro de diluições decimais seriadas do DNA digerido foi submetido a PCR com ciclos curtos (40 ciclos consistindo de 94 °C por 30 segundos e 60 °C por 30 segundos). Duas reações paralelas foram realizadas utilizando-se dois pares de primers: (1) delimitando as junções da DC (entre as posições 8273 e 13720 do DNAmt); (2) delimitando um fragmento que está presente no DNAmt normal e deletado (entre as posições 5472 e 5982 do DNAmt). As densidades ópticas (DO) das bandas obtidas foram medidas e colocadas em gráfico em função do logaritmo das diluições do DNA usado para a amplificação (os pontos correspondentes à fase de saturação da amplificação foram excluídos). A análise de regressão linear foi realizada para a identificação da diluição correspondente ao desaparecimento de cada banda e estimamos a relação de DNAmt deletado/ DNAmt total (relação d/t) (DiDonato et al, 1993).

Segregação da deleção comum com uma mutação de ponto patogênica do DNAmt

Inicialmente amplificamos, por PCR, dois fragmentos de DNA total obtido de músculo: (1) delimitando a posição da mutação de ponto patogênica (8344 ou 8356) e a junção da DC (fragmento CD+), que pode originar produto somente de moléculas de DNAmt contendo a DC, e (2) delimitando a posição da mutação patogênica e a posição 8582 do DNAmt (fragmento CD-), que corresponde a moléculas de DNAmt sem a DC. As condições de amplificação foram as seguintes: 30 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 55 °C por 1 minuto, 72 °C por 1 minuto seguido de uma última etapa a 72 °C por 10 minutos. Os produtos da amplificação foram purificados a partir de gel de agarose (QUIEX kit - Quiagen) e utilizados (1 µl) para uma segunda amplificação com primers oligonucleotídeos delimitando as posições 8344 ou 8356 do DNAmt (Silvestri et al, 1992; Zeviani et al, 1993). A porcentagem de DNAmt com a mutação patogênica foi determinada por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), utilizando-se a enzima BanII para a mutação 8344 e DraI para a mutação 8356 (Silvestri et al, 1992).

Detecção de deleções múltiplas do DNAmt por PCR longo

As condições do PCR foram ajustadas para a amplificação de fragmentos longos através do uso de Expand® Long Template System (Boehringer Mannheim) essencialmente como descrito (Tengan & Moraes, 1996). Foram utilizados aproximadamente 500 ng de DNA total obtidos de músculo esquelético, primer oligonucleotídeo forward das posições 3116 a 3134 do DNAmt, primer reverso das posições 13720 a 13692 do DNAmt, 350 µM de dNTPs, 2,62 unidades de DNA polimerases Expand® e o tampão nº 1 do fabricante (tris-HCl 500mM, pH = 9,2, (NH4)2SO4 160mM, MgCl2 17,5mM). As reações foram realizadas por 30 ciclos com fase de denaturação a 94 °C por 30 segundos e pareamento (annealing)/extensão a 68 °C por oito minutos com 20 segundos de extensão de tempo nos últimos 20 ciclos. Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 0,6%. Para confirmarmos a origem do DNAmt, os produtos de PCR foram transferidos do gel para uma membrana de nylon e hibridizados com uma sonda, marcada com 32P, específica para as posições 3305 a 12413 do DNAmt (não compreendendo as regiões dos primers). As bandas obtidas em auto-radiografia foram quantificadas em termos de densidade óptica utilizando-se um densitômetro, e um gráfico com as intensidades de cada banda foi analisado.

 


RESULTADOS

Análise quantitativa da deleção comum do DNAmt

Foram estudados o DNA muscular de nove controles de necrópsia (com idades variando de três a 91 anos) e 9 pacientes com uma doença mitocondrial (idades de três a 59 anos). Observamos um aumento exponencial de deleção comum (relação d/t) variando de 0,00000001% (três anos) a 1,07% (91 anos) no grupo controle. Embora a relação d/t tenha aumentado com a idade, observamos grande variação entre os valores individuais. O grupo de pacientes tinha idades variando de três a 45 anos e a relação d/t entre 0,000014% (três anos com mutação A3243G) e 0,15% (36 anos com mutação A8344G). A análise por regressão linear demonstrou uma correlação positiva entre a idade e o logaritmo da relação d/t em controles (r = 0,80) e pacientes com mutação de ponto patogênica (r = 0,69) (figura 1). Comparando as duas regressões (teste T) observamos que as inclinações das curvas eram semelhantes (controles = 0,078, pacientes = 0,072). Houve uma tendência a valores mais altos no grupo de pacientes; no entanto, a diferença entre os interceptos no eixo y não foi estatisticamente significante.

 

figura 1
Figura 1 - Níveis de deleção comum do DNAmt em músculo de controles normais e pacientes com defeitos na função oxidativa. A proporção de deleção comum foi comparada com o total de moléculas de DNAmt total (relação d/t) em músculo esquelético de 9 controles (pontos brancos) e 9 pacientes. Obtivemos uma correlação linear entre o logaritmo da relação d/t e idade nos controles (linha clara) e nos pacientes com mutações de ponto do DNAmt (linha escura). A equação da regressão linear para o grupo controle foi : log d/t = - 6,45 + 0,072 x idade (r = 0,81) e para o grupo de pacientes (mutação de ponto) foi : log d/t = - 4,44 + 0,078 x idade (r = 0,69).

 

Segregação da deleção comum com uma mutação de ponto patogênica do DNAmt

Já foi demonstrado que mutações de ponto do DNAmt causam um defeito na cadeia respiratória (Shoffner et al, 1990; Moraes et al, 1993; Morgan-Hughes et al, 1995). Este defeito se deve, na maioria dos casos, a altas proporções de DNAmt mutado (Moraes et al, 1993; Moraes et al, 1992a; Moraes et al, 1992b) nas fibras musculares deficientes. Assim, espera-se que os radicais livres sejam gerados de forma mais abundante nestas células e, portanto, as moléculas de DNAmt mutado seriam mais susceptíveis às deleções do que as moléculas de DNAmt normal.

Se uma mutação de ponto do DNAmt tem um efeito na geração de deleções do DNAmt associadas ao envelhecimento, é possível que as moléculas contendo a mutação de ponto sejam preferencialmente deletadas quando comparadas com as moléculas normais. Esta análise tem como objetivo identificar em qual tipo de molécula de DNAmt (DNAmt normal ou DNAmt mutado) a deleção comum ocorre preferencialmente. Analisamos a segregação destas mutações do DNAmt em seis pacientes com mutações de ponto patogênicas do DNAmt nas posições 8344 ou 8356. Um paciente com a mutação T8356C (82% de DNAmt mutado) mostrou níveis aumentados da mutação 8356 (97%) em moléculas com a deleção comum, comparado com 77% da mesma mutação em DNAmt sem a deleção comum. Entretanto, quando os resultados são analisados conjuntamente, não há diferença estatisticamente significante entre as porcentagens da mutação patogênica obtidas de amplificações de fragmentos CD+ e CD- (teste de Mann-Whitney). Não observamos efeito da idade na porcentagem de mutação de ponto em fragmentos CD+ ou CD-.

Detecção de deleções múltiplas do DNAmt por PCR longo

A amplificação por PCR longo foi obtida a partir de DNA muscular de oito controles (média de idade = 36,37 anos) e nove pacientes com mutações de ponto patogênicas do DNAmt (média de idade = 36,44 anos). Os dois grupos eram similares em relação à idade (teste Mann-Whitney p = 0,49). O produto normal esperado, de 10,6 kb, foi detectado em todos os controles e pacientes. Bandas menores estavam presentes em ambos os grupos com diferentes tamanhos variando de
0,95 kb a 7,0 kb. O número de bandas anormais variou de dois a seis (média = 4,25) no grupo de pacientes e de três a seis (média 3,66) no grupo de controles. A maioria das bandas tinha de 2,6 a 7,0 kb em tamanho, sugerindo a presença de deleções de 3 a 7,4 kb. Observamos uma banda predominante em quaisquer dos grupos, mas uma banda de 1 kb foi detectada somente no grupo de pacientes (quatro em nove pacientes). Analisando as DO das bandas menores comparadas com o total de DO de todas as bandas em cada amostra, pudemos observar que o grupo de pacientes tinha 23,4% (média) do sinal derivado das bandas menores, enquanto no grupo controle esta proporção era de somente 9,7% do total das bandas.

 


DISCUSSÃO

A origem das deleções do DNAmt associadas com o envelhecimento ainda é desconhecida. As deleções poderiam ser originadas por pelo menos duas maneiras: as deleções apareceriam ao longo da vida, iniciando-se principalmente nas fases mais tardias, ou as deleções já existiriam desde o nascimento, acumulando-se durante a vida, por expansão clonal. A hipótese mais utilizada para explicar o aparecimento dessas deleções está baseada na teoria de radicais livres (Harman, 1992), justificando o aparecimento de novas deleções ao longo da vida. Embora não exista uma comprovação de uma ligação direta entre radicais livres e alterações do DNAmt, existem evidências indiretas reforçando esta hipótese: 1) a cadeia respiratória é uma importante fonte de radicais de oxigênio; 2) foi demonstrada uma boa correlação entre níveis de 8-OHdG e níveis de deleções do DNAmt do envelhecimento (Hayakawa et al, 1992); 3) maior produção de radicais livres em insetos no envelhecimento (Sohal, 1991); 4) maior susceptibilidade do DNAmt para a lesão oxidativa (Mecocci et al, 1993).

Os radicais livres estão presentes normalmente nas células, mas teoricamente, para que o DNAmt comece a ser lesado, é necessário que a produção de radicais esteja aumentada, os mecanismos de defesa estejam diminuídos ou ineficazes e/ou haja um defeito nos mecanismos de reparo de lesões do DNA. Estes três fatores poderiam agir conjunta ou isoladamente. No entanto, vários estudos mostram aumento da atividade da superóxido dismutase ligada ao Mn++ em animais e em humanos (Yen et al, 1994; Santiago et al, 1993; Hiramatsu et al, 1992), que é explicado como reacional ao aumento de radicais livres, principalmente os peróxidos lipídicos. Barnett & King (1995) não observaram diminuição das enzimas antioxidantes mas diminuição dos mecanismos de reparo do DNA com a idade em eritrócitos humanos.

Apesar das evidências apontando para o envolvimento da mitocôndria no envelhecimento, sugerido pelo declínio da atividade dos complexos da cadeia respiratória (Trounce et al, 1989; Cooper et al, 1992; Ferrandiz et al, 1994) e presença de deleções do DNAmt (Cortopassi & Arnheim, 1990; Cortopassi et al, 1992; Torii et al, 1992; Lee et al, 1994; Corral-Debrinski et al, 1992a; Corral-Debrinski et al, 1992b; Soong et al, 1992), até o momento não se sabe se as deleções do DNAmt encontradas no envelhecimento são as causadoras do defeito da cadeia respiratória. O comprometimento da mitocôndria no processo de envelhecimento é uma idéia bastante atraente, pois justificaria o comprometimento de vários órgãos, principalmente o coração e o cérebro. Juntando-se a idéia de que os radicais livres seriam os responsáveis por este processo e as evidências de uma alteração mitocondrial, surgiu a hipótese do ciclo vicioso: lesão do DNAmt afetaria a função da cadeia respiratória, levando a maior geração de radicais livres, que por sua vez levariam à lesão adicional do DNAmt, incluindo a produção de deleções (Hayakawa et al, 1992; Nagley et al, 1993; Tanaka et al, 1996). Esta hipótese é baseada na idéia de que um defeito numa proteína mitocondrial da cadeia respiratória interromperia o fluxo contínuo de elétrons, levando a um acúmulo a montante e à conseqüente produção de radicais livres (Bandy & Davison, 1990). Considerando-se este ciclo vicioso como um fator importante para a produção das deleções do DNAmt no envelhecimento, esperaríamos que um defeito na cadeia respiratória levasse a um aumento de radicais livres e maior produção de deleções. Avaliando-se os níveis relativos da deleção comum do DNAmt em pacientes que apresentam mutações do DNAmt e, portanto, uma alteração da cadeia respiratória, esperávamos encontrar um acúmulo mais acelerado dessas deleções em comparação com indivíduos normais, além de segregação da DC com o DNAmt contendo uma mutação patogênica e maior número de deleções em pacientes. Nosso estudo, entretanto, não mostrou o esperado, sugerindo que o ciclo vicioso, se ele realmente ocorre, não seria um fator importante para o acúmulo dessas deleções.

 


AGRADECIMENTOS

Este trabalho contou com o apoio do CNPq (Dra. Célia H. Tengan) e PEW Charitable Trust (Dr. Carlos T. Moraes).

 


REFERÊNCIAS

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1. Disciplina de Neurologia Clínica. Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina

2. Departamentos de Neurologia e de Anatomia e Biologia Celular. Faculdade de Medicina, Universidade de Miami - EUA

Endereço para correspondência: Dra. Célia Harumi Tengan. Disciplina de Neurologia Clínica. Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina. Rua Botucatu nº 740 - São Paulo - SP, CEP 04023-900. Fax: (011) 575-5040. e-mail: chtengan@sun-nepi.epm.br

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de

Psiquiatria
Clínica
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Dúvidas ou sugestões: LF Tófoli ou Roberto B Sassi

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