Laser - Anlise in vitro da Proliferao Celular de Fibroblastos de Gengiva Humana Tratados com Laser de Baixa Potncia.
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Laser

Anlise in vitro da Proliferao Celular de Fibroblastos de Gengiva Humana Tratados com Laser de Baixa Potncia.

21/06/2004
 

Luciana Almeida-Lopes
Dissertao apresentada ao Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade Vale do Paraba como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Mestre em Cincias, do Curso de Ps-Graduao em Engenharia Biomdica.
Orientador:Prof. Dr. Renato Amaro Zngaro
Co-orientador :Prof. Dr. Joo Guidugli Neto
So Jos dos Campos, SP, 1999

 
 
 
RESUMO | ABSTRACT | INTRODUO | REVISO LASER | REVISO REPARO TECIDUAL |PROPOSIO | MATERIAIS E MTODOS | RESULTADOS | DISCUSSO | CONCLUSES | REFERNCIAS | ABREVIAES

 

Resumo

O laser operando com baixa potncia tem sido utilizado em tratamentos mdicos e odontolgicos visando sua ao teraputica sobre os diferentes tecidos biolgicos. Esse tipo de laser tem sido estudado desde a dcada de 60, principalmente por seus efeitos na reparao tecidual, melhorando a regenerao e cicatrizao de tecidos.

A cicatrizao tecidual, por sua vez, um processo complexo que envolve atividade local e sistmica do organismo, sendo os fibroblastos uma das clulas diretamente envolvidas nesse complexo processo. A ao teraputica do laser na cicatrizao tambm bastante complexa, induzindo efeitos locais e sistmicos; trfico-regenerativos, antiinflamatrios e antilgicos. Estes efeitos foram demonstrados em estudos "in vitro" e "in vivo", destacando-se trabalhos que enfatizam o aumento da microcirculao local, ativao do sistema linftico, proliferao de clulas epiteliais e de fibroblastos, assim como o aumento da sntese de colgeno por parte desses ltimos.

Desenvolvemos uma linhagem de fibroblastos de gengiva humana, propondo dois modelos de estudo "in vitro" onde trabalhamos com fibroblastos em condio de dficit nutricional parcial (meio de cultivo com 5% de soro fetal bovino) e em condio de dficit nutricional total (meio sem soro fetal bovino), simulando duas situaes de estresse, j que os dados da literatura nos mostram que esse tipo de laser no age em clulas e tecidos em homeostase. Verificamos que o primeiro modelo o ideal para se trabalhar com essas clulas. Analisamos a proliferao celular nessa linhagem por meio da contagem do nmero de clulas existentes antes e depois de receberem irradiao com diodos lasers operando em diferentes comprimentos de onda. Verificamos que quando as clulas receberam irradiao com mesma irradincia e fluncia o comprimento de onda que induziu maior proliferao celular foi aquele situado na regio do visvel. No caso onde se manteve mesma fluncia mas diferente irradincia, o melhor resultado foi obtido com radiao no infravermelho. Em ambos os casos os grupos irradiados apresentaram proliferao significativamente maior nos grupos irradiados quando comparados ao controle.



Abstract

The Low Level Laser Therapy (LLLT) has been used in medicine and dentistry due to its therapeutical action on the different biological tissues. The use of LLLT has been studied since 60s mainly to improve wound healing, in order to get the healing better besides scarring of soft tissues.

Wound healing is a very complex involving-process local and systemic body activity, and fibroblasts are considered one of the most important cells on healing to be directly involved in this process. The LLLT action in wound healing is so complex, induced by local and systemic effects: several studies have shown that laser light can have healing, anti-inflammatory and analgesic effects both "in vitro" and "in vivo" studies. Those were also associated for increasing the local circulation, the effects on the lymphatic system, the proliferation of epithelial cell and fibroblasts and also for improving collagen production.

We developed a primary culture of human gingival fibroblasts proposing two study models "in vitro" with fibroblasts, the former with partial and the latter with total decreased nutritional condition in order to simulate a stress situation, due the literature has showed us that the LLLT doesnt act in cells and tissues in homeostasis. We verified that the former is more appropriated for this kind of studies. It was analysed the cellular proliferation on this primary culture by counting of the cell number that had existed after and before the irradiation with different wavelength. We had observed that cells irradiated by the same irradiance and fluence presented higher proliferation when by receiving visible laser light. In case where the cells received the same fluence but different irradiance, the best results were obtained with infrared laser. In both irradiated groups, the cells proliferation was bigger than non-irradiated ones.


1. Introduo

A palavra laser um acrnimo com origem na lngua inglesa: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (Amplificao de Luz por Emisso Estimulada de Radiao). Esta radiao eletromagntica no ionizante, sendo um tipo de fonte luminosa com caractersticas bastante distintas daquelas de uma luz fluorescente ou de uma lmpada comum.

A radiao laser monocromtica, ou seja, emite radiaes em um nico comprimento de onda. uma radiao com coerncia espacial e temporal onde as ondas propagam-se com a mesma fase no espao e no tempo. Sua direcionalidade permite a obteno de alta densidade de energia concentrada em pequenos pontos. Com o auxlio de dispositivos pticos, sua radiao pode ainda ser polarizada.

So justamente as caractersticas especiais desse tipo de luz que a faz ter propriedades teraputicas importantes (Laser de Baixa Potncia ou Teraputico) assim como ser utilizada em cirurgias com vantagens muito superiores ao uso do bisturi convencional (Laser de Alta Potncia ou Cirrgico). As radiaes pticas produzidas por esses lasers tm basicamente as mesmas caractersticas, porm se trabalha com o laser buscando resultados clnicos bastante especficos.

A clula tem um limiar de sobrevivncia, segundo o tecido onde ela est localizada e segundo seu estado fisiolgico. Quando trabalhamos respeitando esse limiar de determinada clula, lhe oferecemos uma baixa intensidade de energia, que ser utilizada por ela de maneira que ir estimular sua membrana, ou suas mitocndrias. Dessa forma estaremos induzindo essa clula biomodulao, ou seja, ela trabalhar buscando um estado de normalizao da regio afetada, isso denomina-se Laser Terapia. Sua principal indicao so todos os quadros patolgicos onde se gostaria lograr melhor qualidade e maior rapidez do processo reparacional (quadros de ps-operatrio, reparao de tecido mole, sseo e nervoso), quadros de edema instalado (onde se busca uma mediao do processo inflamatrio), ou nos quadros de dor (crnicas e agudas). Quando, ao contrrio, se oferece uma densidade to alta de energia a ponto dessa energia transformar-se em dano trmico e ultrapassar o limiar de sobrevivncia dessa clula, estaremos utilizando o laser com finalidade cirrgica, e isso denominamos Laser Cirurgia.

O comprimento de onda fator determinante na interao laser-tecido. Corresponde distncia percorrida pela onda em uma oscilao completa. sendo medida em nanometros (nm) e a freqncia de suas oscilaes em Hertz (Hz). O comprimento de onda pode variar desde o infravermelho distante at os raios csmicos e segundo seu meio ativo, onde gerada a radiao. o meio ativo, em geral, que d o nome ao laser determinando sua pureza espectral e seu comprimento de onda, conferindo caractersticas diferentes de emisso e de possvel ao biolgica.

A radiao laser pode ser refletida, transmitida, absorvida ou espalhada (scattering) pelo tecido. A monocromaticidade do laser determina a absoro seletiva por parte dos cromforos, com resposta afim a um ou a vrios comprimentos de onda, fenmeno conhecido como ressonncia uma determinada freqncia. Cada comprimento de onda, portanto, ter um tipo diferente de interao segundo o tecido alvo.

A utilizao do laser operando com baixa potncia tem sido estudada desde os anos 60, sendo Mester (1966) um dos pioneiros em demonstrar seus efeitos na reparao tecidual.

Os efeitos teraputicos dos lasers sobre os diferentes tecidos biolgicos so muito amplos, ao induzir efeitos trfico-regenerativos, antiinflamatrios e analgsicos, os quais se tm demonstrado em estudos tanto in vitro como in vivo; destacando-se os trabalhos que demonstram um aumento na microcirculao local (MIR et al., 1984; MAIER et al., 1990), no sistema linftico (LIEVENS, 1986; 1988; 1990; 1991), proliferao de clulas epiteliais (STEINLECHNER e DYSON, 1993) e fibroblastos (LUBART et al., 1995; WEBB et al., 1998; ALMEIDA-LOPES et al., 1998b) assim como aumento da sntese de colgeno dos fibroblastos (ENWEMEKA et al., 1990; SKINNER et al., 1996). Muitos estudos clnicos foram publicados (TRELLES et al., 1989a; BIHARI e MESTER, 1989; ROCHKIND et al., 1989; BAXTER, 1994; KAMEYA et al., 1995; TANG et al., 1997; REDDY et al., 1998) confirmando esses efeitos observados no laboratrio.

Os estudos in vitro sobre fibroblastos descrevem um efeito proliferativo e/ou ativador da sntese protica, dependendo das caractersticas e parmetros do laser utilizado como: comprimento de onda, forma de emisso, densidade de potncia e densidade de energia utilizadas. Muitos autores como ABERGEL et al., 1986; 1988; KARU, 1990; AL-Watban e ZHANG, 1994 entre outros (BALBONI et al., 1985; HALLMAN et al., 1988; SOUNDRY et al., 1988; MESTER e MESTER, 1989; POURREAU-SCHNEIDER et al., 1989; 1990; LOEVSCHALL et al., 1994; NOGUEROL et al., 1994; HALEVY et al., 1997) trabalharam in vitro com fibroblastos, principal clula responsvel na reparao. Estes estudos se correlacionam com outros in vivo que mostraram efeitos, tal como a reduo do tempo de cicatrizao de feridas dentro do estrato cutneo e de mucosas (ABERGEL, et al., 1988; TERRIBILE et al., 1992; TRELLES et al., 1989; BIHARI E MESTER, 1989; ROCHKIND et al., 1989; AL-WATBAN e ZHANG, 1994; HALEVY et al., 1997).

A reparao tecidual um processo complexo que envolve atividade local e sistmica do organismo, sendo os fibroblastos uma das clulas diretamente envolvidas nesse complexo processo.

A ao dos diferentes comprimentos de onda no metabolismo celular vem sendo estudada por diferentes autores. J se sabe que a ao desses lasers variam segundo a posio que ocupam no espectro de radiaes eletromagnticas, e que a ao sobre as clulas diferente para os comprimentos de onda infravermelhos e para os visveis (KARU, 1988). Porm, a resposta clnica no varia intensamente.

O objetivo deste trabalho analisar o efeito, in vitro, dos diodos laseres operando em 670, 780 e 786 nm sobre a proliferao de fibroblastos de gengiva humana.


2. Reviso da Literatura

2.1. Laser
2.1.1. Introduo

Os laseres tiveram sua aplicao inicial no setor blico, mas foram rapidamente introduzidos na rea mdica. As aplicaes em oftalmologia e dermatologia foram as que incorporaram a tecnologia laser com maior rapidez.

Se a radiao de um laser de alta potncia atingir um tecido alvo, dependendo do coeficiente de absoro deste tecido, ele poder sofrer carbonizao, vaporizao, coagulao ou ainda simplesmente ter suas protenas constituintes degradadas ou desnaturadas. O que essas reaes tm em comum o fato de que em todas elas a estrutura do tecido atingido destrudo ou alterado permanentemente. Alm desses efeitos foto-trmicos, existem outros efeitos no dependentes de calor, os quais criam igualmente alteraes irreversveis ou destruio do tecido, que so os efeitos: foto-osmtico, foto-inico, foto-enzimtico e foto-imunolgico (FULLER, 1983; OHSHIRO e CALDERHEAD, 1988), entre outros.

Quando o laser de alta potncia, que neste trabalho tratamos como laser cirrgico, comeou a ser utilizado em Medicina, observou-se que os pacientes submetidos a esse tipo de cirurgia relatavam menor desconforto ps-operatrio e os mdicos usurios desse tipo de equipamento observavam menor quadro de edema ps-cirrgico e melhor cicatrizao tecidual quando comparado ao mtodo de cirurgia convencional. Levantou-se ento a suspeita de que o laser poderia ter algum outro efeito adicional at ento desconhecido, at que OHSHIRO e CALDERHEAD, em 1991, propuseram chamar esse efeito de "Efeito X do Laser". Estes autores propuseram que a explicao para este efeito seria a distribuio espacial de energia gaussiana que a maioria dos laseres apresentam. A figura 2.1, exemplifica o perfil gaussiano de um feixe laser, sendo que o pico de energia concentra-se na regio central do feixe, decrescendo gradualmente medida que se aproxima da periferia. Ela representa tambm os efeitos tpicos da interao laser-tecido biolgico, evidenciando estes efeitos em funo da variao da densidade de energia. Na regio de interface entre a desnaturao protica e a ativao foto-trmica a temperatura no ultrapassa 40C. Na regio correspondente ativao foto-trmica haver um aumento da temperatura, porm no suficiente para causar mudana estrutural macroscpica no tecido, devendo somente ativ-lo. Na zona mais afastada, temos uma regio denominada no foto-trmica, mas que ainda assim pode sofrer ativao. Essas duas ltimas zonas no mostram alterao macroscpica na estrutura tecidual (CALDERHEAD, 1998), ainda que os dados da literatura comprovem efeitos sobre o mesmo. Estes efeitos so conhecidos atualmente como "Terapia com Laser de Baixa Potncia" ou "Laser Terapia" (OHSHIRO e CALDERHEAD, 1998), e podem ocorrer simultaneamente s reaes foto-destrutivas do laser cirrgico. OHSHIRO e CALDERHEAD, 1991, relatam este efeito como "Laserterapia Simultnea". Neste trabalho utilizamos a terminologia de "Efeito Residual do Laser Cirrgico".

Tendo o efeito residual como ponto de partida, sistemas laseres foram desenvolvidos especialmente para este tipo de aplicao.


 

Figura 2.1: Perfil espacial gaussiano de um feixe laser e sua interao com o tecido, proposto por OHSHIRO e CALDERHEAD em 1988.

2.1.2. Aspectos Histricos

O primeiro laser da histria foi construdo em 1960 por Theodore maiman na Califrnia-USA (maiman, 1960), era um laser de Rubi, operando em 694,3 nm. Em 1961 foi fundado, na Universidade de Cincinnati por Leon Goldman, o primeiro laboratrio de laser para aplicaes mdicas (GOLDMAN, 1981), onde as primeiras experincias em animais foram realizadas.

Em 1962 PATEL desenvolveu o primeiro laser com finalidade teraputica, um Hlio-Nenio (He-Ne) com comprimento de onda de 632,8 nm (PNTINEN, 1992).

As primeiras aplicaes clnicas com laser operando em baixa potncia foram relatadas em 1966 por Endre Mester de Budapeste, Hungria, que apresentou os primeiros relatos de casos clnicos sobre "Bioestimulao com Laser" de lceras crnicas de membros inferiores usando laseres de rubi e de argnio, tendo publicado seus primeiros artigos em 1966 (MESTER, 1966). Ele produziu um grande volume de trabalhos cientficos, clnicos e experimentais, tendo o laser de He-Ne, como tema central.

Os laseres teraputicos mais utilizados nas dcadas de 70 e 80 foram os de He-Ne com emisso na regio do visvel. Nesta regio do espectro eletromagntico, a radiao laser apresenta pequena penetrao nos tecidos biolgicos, o que limita a sua utilizao. Para aplicao desse tipo de laser em leses mais profundas, era necessrio uma fibra ptica para guiar a radiao at o interior do corpo do paciente, limitando e contra-indicando muitas vezes esse tipo de terapia, por ser uma tcnica invasiva. Outra limitao dos laseres de He-Ne era sua grande dimenso e tambm o fato de seu meio ativo estar contido por ampolas de vidro que poderiam romper-se facilmente, alm do gs Hlio permear rapidamente a parede da ampola, reduzindo drasticamente o tempo de vida destes aparelhos.

Em 1973, seguindo a mesma linha de Mester, Heinrich Plogg de Fort Coulombe - Canad, apresentou um trabalho sobre "O uso do laser em acupuntura sem agulhas", para atenuao de dores (BAXTER,1994). A partir do final dessa dcada comearam a ser desenvolvidos diodos laseres semicondutores, dando origem ao primeiro diodo operando na regio do infravermelho prximo (l = 904nm), constitudo de um cristal de Arsenieto de Glio (As-Ga). As vantagens deste sobre o He-Ne que, alm da menor dimenso, apresenta maior penetrao no tecido biolgico. Outra vantagem que este dispositivo pode operar de forma contnua ou pulsada, enquanto que o He-Ne s opera em modo contnuo. O efeito da foto-bioestimulao com laser pulsado foi tema de diferentes trabalhos, sendo que MORRONE et al., em 1998, demonstraram que para aplicaes in vivo a radiao contnua apresenta melhores resultados que a radiao pulsada

Em 1981, apareceu pela primeira vez o relato da aplicao clnica de um diodo laser de As-Ga-Al, publicado por CALDERHEAD (1981), do Japo, que comparava a atenuao de dor promovida por um diodo laser e o laser de Nd:YAG, (Ytrio e Alumnio, dopado com Neodmio), operando em 1064 nm.

partir dos anos 90, diferentes dopantes foram introduzidos na tecnologia para obteno de diodos laser gerando uma larga faixa de comprimentos de onda, conforme pode ser observado na tabela 2.1. Com estes dispositivos hoje pode-se ter aparelhos pequenos, de fcil transporte e manuseio, com baixa freqncia de manuteno alm do baixo custo.

Tabela 2.1: Diodos Laseres Semicondutores com diferentes hospedeiros e dopantes.
MATERIAL
SMBOLO
COMPRIMENTO DE ONDA (mM)
Fosfeto arsenieto de glio
GaAsP
0.65 - 0.9
Arsenieto de glio e alumnio
AlGaAs
0.65 - 0.9
Arsenieto de glio
GaAs
0.9
Fosfeto de ndio 
InP
0.91
Antimonieto de glio 
GaSb
1.5
Fosfeto arsenieto de ndio
InAsP
1.6
Arsenieto de glio-ndio 
InGaAs
1.8 - 2.1
Fosfeto de glio-ndio 
InGaP
0.76
Arsenieto de ndio 
InAs
3.1
Arsenieto de antimnio-ndio 
InAsSb
3.2
Antimonieto de ndio
InSb
5.4
Sulfeto de chumbo 
PbS
4.3
Telureto de chumbo 
PbTe
6.5
Seleneto de chumbo 
PbSe
8.5
Telureto de chumbo 
PbSnTe
6.5 30
Seleneto de chumbo-estanho 
PbSnSe
10 - 12

2.1.3. Aspectos Tericos

2.1.3.1. Conceito de Irradincia e Fluncia

Irradincia o termo que os foto-biologistas usam como sinnimo para densidade de potncia (DP), que definida como sendo a potncia ptica de sada do laser em Watts, dividida pela rea irradiada em cm2. atravs do controle da irradincia que o cirurgio pode cortar, vaporizar, coagular ou "soldar" o tecido, quando da utilizao de laseres cirrgicos. A densidade de potncia apropriada pode tambm gerar foto-ativao com laser de baixa potncia.

O outro fator sobre o qual o clnico tem controle o tempo de exposio. Multiplicando a irradincia pelo tempo de exposio dado em segundos, pode-se obter a fluncia ou densidade de energia (DE) em joules/cm2.

Para uma dada potncia, a irradincia e a fluncia podem produzir efeitos sobre o tecido biolgico que podem ser nitidamente diferenciados. Por exemplo, um laser com potncia de sada de 10 W, irradiando uma rea de 10 cm2 (F = 3,5 cm), ter uma irradincia de 1 W/cm2. Se o tempo de exposio for igual a 10 minutos, a fluncia ser de 600 J/cm2, o que pode ser considerado como alta energia, causando inclusive dano no tecido alvo. Se o mesmo laser for focalizado sobre uma rea de 8 cm2, (F = 0,4 mm), a irradincia ser aumentada de oito vezes, possivelmente gerando dano trmico ao tecido. Se neste segundo caso, o tempo de exposio for reduzido para 1 milisegundo (0,001 s), ento a fluncia decresce drasticamente atingindo valores da ordem de 8 J/cm2, valores tipicamente utilizados em terapia com laser de baixa potncia.

2.1.3.2. Comprimento de Onda

O comprimento de onda extremamente importante pois ele quem define a profundidade de penetrao no tecido alvo (BOURGELAISE, 1983; FULLER, 1983). Diferentes comprimentos de onda apresentam diferentes coeficientes de absoro para um mesmo tecido. Na figura 2.2, JACQUES (1995) resume os diferentes coeficientes de absoro para diferentes tecidos em funo do comprimento de onda. Como podemos observar, as radiaes emitidas na regio do ultravioleta e na regio do infravermelho mdio apresentam alto coeficiente de absoro pela pele, fazendo com que a radiao seja absorvida na superfcie, enquanto que na regio no infravermelho prximo (820 nm e 840 nm) constata-se baixo coeficiente de absoro, implicando em mxima penetrao no tecido (KARU, 1985; 1987).

 

Figura 2.2: Coeficientes de absoro para diferentes tecidos em funo do comprimento de onda, proposto por JACQUES em 1995.

2.1.3.3. Conceito de Foto-bioativao

O laser operando em baixa potncia foi considerado por MESTER, em 1969, um Bioestimulador, e por isso, por um determinado perodo de tempo, encontramos na literatura essa terminologia utilizada como sinnimo para designar esse tipo de laser, que tambm era chamado de laser de bioestimulao. Ainda no se conhecia muito bem seu mecanismo de ao nessa poca, e o que se observava era que os terapeutas tinham excelentes resultado no tratamento de feridas e lceras abertas, estimulando seu processo de cicatrizao. Porm, com o passar do tempo, essa terapia comeou a ser utilizada no s para estimular e acelerar processos mas tambm para det-los. MESTER (1969) escolheu a terminologia "Bioestimulao" porque ele basicamente utilizava essa terapia para acelerar o processo de cicatrizao. Entretanto, essa terapia passou a ser utilizada muitas vezes buscando efeitos antagnicos no tecido biolgico: foi utilizada para remover excessos de pigmento, mas tambm para restaurar a falta deles (SASAKI e OHSHIRO, 1989); para tratar cicatrizes deprimidas, mas tambm cicatrizes hipertrficas (STRONG, 1997); para aliviar a dor, mas tambm para fazer com que a sensibilidade voltasse a instalar-se em reas de parestesia ou paralisia (ROCHKIND et al., 1989); para controlar hipotenso, mas tambm para tratar hipertenses (ASAGAI et al., 1998). A partir de estudos clnicos e laboratoriais pde-se concluir que essa terapia no somente acelerava determinados processos, mas tambm retardava outros. Os autores comearam ento a entender que nesse tipo de terapia o laser desempenhava um papel de normalizador das funes celulares e OSHIRO e CALDERHEAD em 1991, propuseram a expresso "Balanceador e Normalizador de funes".

2.1.4. Diferena da Ao entre a Luz Laser Visvel e Infravermelha

A energia dos ftons de uma radiao laser absorvida por uma clula ser transformada em energia bioqumica e utilizada em sua cadeia respiratria. Tina Karu em 1988, descreveu um mecanismo de ao diferente para os laseres emitindo radiao na regio do visvel e do infravermelho prximo (Fig. 2.3).

A luz laser visvel induz a uma reao foto-qumica, ou seja, h uma direta ativao da induo de sntese de enzimas (BOLOGNANI et al., 1993; OSTUNI et al., 1994; BOLTON et al., 1995), e essa luz tem como primeiros alvos os lisossomos e as mitocndrias das clulas.

As organelas no absorvem luz infravermelha, apenas as membranas apresentam resposta este estmulo. As alteraes no potencial de membrana causadas pela energia de ftons no infravermelho prximo (PASSARELA et al., 1984) induzem a efeitos foto-fsicos e foto-eltricos, causando o choque entre clulas que se traduz intracelularmente por um incremento na sntese de ATP (COLLS, 1986).

O mecanismo de interao do laser em nvel molecular, foi descrito primeiramente por KARU (1988). Os incrementos de ATP mitocondrial que se produzem aps a irradiao com laser, favorecem um grande nmero de reaes que interferem no metabolismo celular (Fig. 2.3) (PASSARELA et al., 1984; POURREAU-SCHNEIDER et al., 1989; FRIEDMANN et al., 1991). Em estados patolgicos, o laser interfere no processo de troca inica, acelerando o incremento de ATP (KARU et al., 1991a; YOUNG et al., 1990; LUBART, et al., 1992b; LOEVSCHALL E ARENHOLT-BINDSLEV, 1994; LUBART et al., 1996; LUBART et al., 1997).
 
 
 
 
 
 
 

Figura 2.3: Modelo de KARU modificado por SMITH. Ao foto-qumica do laser visvel na cadeia redox da mitocndria. Ao foto-fsica do laser infravermelho na membrana celular. Ambos desencadeiam uma resposta celular, que gera uma cascata bioqumica de reaes.

2.1.4.1. Atuao da Terapia com Laser de Baixa Potncia

Os laseres utilizados nesse tipo de terapia esto situados na poro visvel do espectro das radiaes eletromagnticas, bem como no infravermelho prximo. Os comprimentos de onda mais utilizados esto entre 600 e 1000 nm, estes comprimentos de onda so relativamente pouco absorvidos e consequentemente apresentam uma boa transmisso na pele e nas mucosas (RIGAU, 1996).

O significado biolgico e clnico da coerncia ainda no est bem definido. Alguns autores como KARU, em 1987, baseados em achados em cultura de clulas e de bactrias, demonstraram que a coerncia no importante. Outros autores como YOUNG et al., 1990, trabalharam com cultura de clulas utilizando linhagem de macrfagos e fibroblastos e demonstraram efeitos foto-bioestimulativos significativos utilizando igualmente fontes de luz no-coerente. Tambm SVAASAND, em 1990, demonstrou que a absoro de ftons advindos das radiaes de laser de baixa potncia por parte de um sistema biolgico, em condies de homeostase, so de natureza no-coerente. A coerncia da luz perde-se nos primeiros estratos da pele, devido ao fenmeno de disperso da luz, antes que se produza a absoro dos ftons por cromforos como a melanina, hemoglobina, porfirinas, citocromo oxidasa, entre outros, e no essencial in vivo, como demonstraram PARRISH, 1980; JORI, 1980; ANDERSON e PARRISH, 1982; MCKINLEY et al., 1988; HAZEKI e TAMURA 1989; YOUNG et al., 1990; TERRIBILE et al., 1992 e LUBART et al., 1995. Dessa forma conclui-se que os efeitos biolgicos dos laseres operando em baixa potncia dependem principalmente de sua monocromaticidade (MESTER et al., 1978; BERKI et al., 1988; KARU 1987; KUBOTA et al. 1989; BIHARI e MESTER, 1989) e da fluncia (SHIROTO et al., 1989; LUBART et al., 1992a; AL-WATBAN e ZHANG, 1994; WEI YU et al., 1994; KARU, et al., 1996), assim como da fase de crescimento celular em que as clulas receberam a irradiao (KARU et al., 1995).

Os diodos laseres e o laser de He-Ne rotineiramente utilizados em aplicaes clnicas com finalidade bioestimulativa, e no inibitria, operam bem abaixo de 1 W, o miliwatt (mW = 0,001 W) mais comumente utilizado para especificar a irradincia nesses sistemas. A irradincia mdia situa-se entre 0,01 e 100 mW/cm2, enquanto que a fluncia entre 0,1 e 10 J/cm2 (TRELLES et al., 1989; MESTER e MESTER, 1989b; ROCHKIND et al., 1989; TERRIBILE et al., 1992; WEI YU et al., 1994; BOLTON et al., 1995).

Para os laseres pulsados e chaveados, alguns autores (DYSON et al., 1991; KARU et al., 1997) especificaram que diferentes freqncias produzem diferentes efeitos biolgicos. Em 1996, EL SAYED e DYSON apresentaram um estudo in vitro sobre o efeito da mdia de pulso e pulso de durao no nmero de mastcitos e sua degranulao. Os autores observaram que o aumento do nmero de mastcitos no foi dependente da freqncia de pulso, enquanto que sua degranulao foi.

Quando os experimentos so feitos in vitro, por exemplo em cultura de clulas cujos cultivos apresentem-se em monocamadas, a luz laser incide e conserva sua polaridade e coerncia. Aqui sim esses fatores podem ser determinantes nos resultados biolgicos gerados.

A absoro de ftons por parte da clula, seja diretamente por captao a nvel de crmoforos mitocondriais ou por ao em sua membrana celular, produz estimulao ou inibio de atividades enzimticas e de reaes foto-qumicas. Estas aes determinam alteraes foto-dinmicas em cascatas de reaes e em processos fisiolgicos com conotaes teraputicas (FUNK et al., 1992; LOEVSCHALL e ARENHOLT-BINDSLEV et al., 1994; LUBART et al., 1997).

Esses processos podem manifestar-se clinicamente de trs modos. Primeiramente vo agir diretamente na clula, produzindo um efeito primrio ou imediato, aumentando o metabolismo celular (KARU et al., 1989; ROCHKIND, et al., 1989; BOLTON et al. 1995), ou por exemplo, aumentando a sntese de endorfinas e diminuindo a liberao de transmissores nosciceptivos, como a bradicinina e a serotonina (ATAKA et al., 1989). Tambm ter ao na estabilizao da membrana celular (PALMGREN, 1992; IIJIMA et al., 1991). Clinicamente observaremos uma ao estimulativa e analgsica dessa terapia. Haver alm disso um efeito secundrio ou indireto, aumentando o fluxo sangneo (SCHENK, 1985; KUBOTA e OHSHIRO, 1989) e a drenagem linftica (LIEVENS, 1986; 1988; 1990; 1991), por exemplo. Dessa forma, clinicamente observaremos uma ao mediadora do laser na inflamao. Por fim, haver a instalao de efeitos teraputicos gerais ou efeitos tardios e clinicamente observaremos, por exemplo, a ativao do sistema imunolgico (MESTER et al., 1977; TRELLES, 1986; SKOBELKIN et al., 1991; VLEZ-GONZLEZ et al., 1994; TUNR e HODE, 1996).

2.1.5. Aplicaes Clnicas

Devido s suas caractersticas de aliviar a dor, estimular a reparao tecidual, reduzir edema e hiperemia nos processos antiinflamatrios, prevenir infeces, alm de atuar em parestesias e paralisias, o laser de baixa potncia tem sido empregado freqentemente em mltiplas especialidades mdicas e odontolgicas.

Na clnica odontolgica existe grande nmero de aplicaes, e o uso dessa terapia j se faz rotineira para bioestimulao ssea, em casos de implantes e cirurgia oral menor; para diminuir a dor e edema nos casos de ps-operatrios diversos, lcera aftosa recorrente, herpes, nevralgias e hipersensibilidades dentinrias; alm de ativar a recuperao em quadros de paralisias e parestesias (ALMEIDA-LOPES, 1997; 1998a).

Em Medicina utiliza-se essa terapia para melhorar a cicatrizao no tratamento de queimados e de pacientes que receberam algum tipo de enxerto ou retalho, ativando a vascularizao dessas regies. Tambm utilizada para o tratamento de dores agudas e crnicas de diversos tipos (KERT e ROSE, 1989) e at mesmo aquelas causadas por herpes genitais e em ps-operatrios diversos em ginecologia. Tambm freqente sua utilizao por fisioterapeutas e por mdicos que trabalham em medicina do esporte naqueles pacientes que sofreram trauma esportivo, devido ao seu emprego com sucesso em quadros de distenses e contraturas musculares (TUNR e HODE, 1996).

2.2. Reparao Tecidual
2.2.1. Introduo

O processo de reparao no um simples processo linear no qual fatores de crescimento disparam a proliferao celular e sim uma integrao de processos interativos dinmicos, que envolve mediadores solveis, elementos figurados do sangue, produo de matriz extra celular e clulas parenquimatosas. Desencadeados, esses processos seguem-se em uma seqncia e tempo especficos. Deve ser separado, na reparao, a regenerao e a cicatrizao. Regenerao quando a reposio tecidual realizada por clulas do mesmo tipo das que foram perdidas. Assim, quando possvel, os parnquimas regeneram. Por outro lado, entende-se por cicatrizao quando a reposio tecidual feita de modo inespecfico, com produo de um tecido conjuntivo prprio: a cicatriz. Ambos os processos esto entremeados, ocorrendo conjuntamente, mas conceitualmente passam-se de maneira diversa. Foge ao escopo deste trabalho estudarmos o fenmeno da regenerao, que tem identidade prpria. Daremos nfase ao estudo da cicatrizao, por estar nele envolvido o fibroblasto.

Os eventos da cicatrizao tecidual podem ser classicamente divididos em trs fases: a fase da inflamao, fase de formao de tecido de granulao com depsito de matriz extracelular e a remodelao tecidual (CLARK, 1993). Essa fases no so mutuamente exclusivas, e sim sobrepostas no tempo.

Para McKinney, 1989, os fatores que influenciam o processo tambm influenciam na aparncia final da dita cicatriz. Segundo o grau de isquemia, oxigenao e aporte de fatores angiognicos de crescimento, que aparecem desde o momento em que se estabelece uma ferida at o momento final de sua remodelao, passando pelo seu processo de reposio de tecidos, haver um processo especfico de cura. O grande cenrio para a reparao combina trs eventos: hemostasia (porque os vasos esto abertos), inflamao (porque houve uma injria), e reparao propriamente dita, pois se estruturas foram lesadas ou destrudas, dever ocorrer reposio de tecidos por regenerao ou por cicatrizao.

O plano bsico do processo de cicatrizao, de uma maneira geral, sempre o mesmo: preencher aquele espao e sel-lo com uma cicatriz. Os detalhes de que forma isso ir evoluir, entretanto, variam segundo a presena ou ausncia de bactrias, a natureza da ferida (se fechada ou aberta), o grau de suprimento sangneo, a quantidade de tecido morto para ser eliminado, o tipo de tecido lesado e muitos outros fatores (MAJNO e JORIS, 1996).

A situao mais favorvel para a cicatrizao quando a ferida est fechada, suturada e no infectada; isto conhecido como ferida incisional, como oposio a ferida excisional, por meio da qual um pedao de tecido removido.

Aqui a cicatrizao pode comear imediatamente, porque no h populao bacteriana significativa e virtualmente no h tecido morto para ser eliminado. Um termo cirrgico para esta situao "cicatrizao por primeira inteno" (Fig. 2.4). Em contra partida, a reposio alongada se h sinal de infeco ou se a ferida permanece aberta devido a uma perda tecidual. Estas duas condies so obstculos que devem ser superados antes que a ferida se feche; este tipo de cicatrizao que ocorre conhecida por "cicatrizao por segunda inteno" (Fig. 2.5).

Figura 2.4: Quadro de uma cicatrizao por primeira inteno numa ferida fechada, no infectada, como uma ferida cirrgica incisional. As margens esto prximas e o processo de cicatrizao evolui diretamente produo de uma cicatriz.

Figura 2.5: Quadro de uma cicatrizao por segunda inteno. Acima: cicatrizao por segunda inteno numa ferida aberta no infectada. A fenda primeiramente preenchida por tecido de granulao, o qual se contrai e torna-se uma cicatriz. Abaixo: cicatrizao por segunda inteno em uma ferida infectada (as setas vermelhas representam as bactrias). A ferida preenchida com tecido de granulao, o qual produz pus at as bactrias serem eliminadas. Depois disso o tecido de granulao contrai e produz uma cicatriz.

2.2.2. Cicatrizao por Primeira Inteno: Fechamento de Feridas Asspticas

A seguir, ser descrita a cicatrizao de uma ferida incisional suturada no infectada. Tecnicamente todas as feridas so infectadas em menor ou maior grau; entretanto na cirurgia assptica o nmero de bactrias bastante reduzido o que faz com que o processo de reparao tecidual no seja perturbado. A seqncia de eventos razoavelmente constante, mas a regulao indicada abaixo meramente indicativa, pois conforme as condies, esses eventos podem ser antecipados e acontecerem na metade desse tempo ou serem postergados, e terem seu tempo de evoluo dobrado.

2.2.2.1. Hemostasia: dentro de segundos a minutos

A primeira prioridade do organismo a hemostasia, ou seja, parar o sangramento. As arterolas lesadas contraem-se e o derramamento de sangue cessa. Alm disso mecanismos de coagulao do sangue so desencadeados. O sangue poder coagular-se por meio de dois mecanismos: intrnseco e extrnseco. No mecanismo extrnseco o processo de coagulao desencadeado pelo contato com colgeno. No intrnseco inicia-se pela influncia da ao de fatores de crescimento liberados por clulas lesadas e por plaquetas e fatores sangneos. Ambos mecanismos so disparados na ferida, e ento o cogulo sangneo forma-se, ajudando a cessar o sangramento.

Uma injria provoca ruptura de vasos sangneos com concomitante extravasamento de seus elementos. A ativao de plaquetas inicia a hemostasia, com sua respectiva adeso parede endotelial dos vasos lesados e conseqente aglutinao. A agregao plaquetria iniciar a formao do cogulo por via intrnseca. Atividades do endotlio intacto do vaso sangneo limitaro o cogulo s reas vasculares lesadas. Enquanto o cogulo sangneo no interior do lmen do vaso mantm a hemostasia, o cogulo presente no espao da ferida prov uma matriz provisria para a migrao celular. Por exemplo, fibrina e fibronectina exsudados atuam como uma matriz provisria para a diapedese de moncitos e a orientao de fibroblastos (GRINNELL et al., 1980).

Enquanto estes eventos passam-se na luz dos vasos, fibrinognio exsudado para o interstcio transforma-se em fibrina e forma uma tnue rede que conecta os dois lados da ferida no chamado leito da ferida. Os prprios produtos do cogulo ajudam a iniciar o processo de reparao. Trombina, a enzima que catalisa a formao de fibrina, atrai macrfagos e causa a replicao de fibroblastos; e o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) liberado por degranulao de plaquetas tambm um mitgeno e um quimiottico para fibroblastos (COLVIN, 1986).

As plaquetas tm dupla funo: alm de facilitarem a formao do tampo hemosttico, tambm secretam citocinas incluindo fatores de crescimento como o PDGF, fator de crescimento transformante a (TGFa ), fator de crescimento transformante b (TGFb ), fator de crescimento epidrmico (EGF), alm de outros mediadores com uma multiplicidade de aes. As plaquetas liberam ainda muitas substncias biologicamente ativas incluindo molculas da matriz extra celular (MEC), como a fibronectina, a trombospondina e o fator de Von Willebrand.

2.2.2.2. Inflamao: dentro de minutos a horas

A inflamao iniciada imediatamente, independente da presena de bactrias na regio. Esse provavelmente um procedimento preventivo que o organismo encontra para no haver uma importante perda de tempo, caso haja contaminao dessa ferida. Aps uma agresso, seguem-se fenmenos iniciais da cicatrizao, conhecidos como "fase de demolio". Levam a uma limpeza ou demolio dos tecidos lesados, restos de agentes, entre outras coisas; o processo no seno uma inflamao assptica, caso no haja agentes contaminantes. Assim sendo, uma grande quantidade de mediadores da inflamao so gerados, um exsudado de clulas e fluido comea a extravasar das vnulas, as arterolas dilatam-se e leuccitos movem-se lentamente, atrados por agentes quimiotticos, como substncias qumicas endgenas ou algum microorganismo. Caso eles encontrem algum, a batalha comea e mais leuccitos so recrutados. Entretanto, numa ferida estril, o nmero de leuccitos no exsudato no suficiente para cham-lo de pus. A limpeza do debridamento, incluindo os neutrfilos remanescentes, comea imediatamente. Os tecidos prximos ferida entumescem um pouco devido ao edema inflamatrio. Nos espaos de tecido conectivo distendidos, os exsudatos coagulam e formam uma fina rede de fibrina; isto, juntamente com a fibronectina, oferece aos leuccitos uma superfcie extra contra a qual eles podem capturar as bactrias (fagocitose de superfcie).

2.2.2.3. Formao da Crosta

A crosta comea a ser formada com o exsudato filtrado da ferida suturada e aparece na superfcie da pele: isso coagula e eventualmente resseca. Este processo continua e forma uma crosta, que tem a importante funo de isolar a ferida do meio ambiente, prevenir a penetrao de bactrias e impedir a dessecao. GRILLO apud MAJNO e JORIS, 1996, da opinio que a crosta um curativo natural da ferida.

2.2.2.4. Migrao de Clulas Fixas: dentro de 24 horas

Aps 24 horas, algumas clulas estacionrias como os fibroblastos, clulas epidrmicas e endoteliais (GROTENDORST e MARTIN, 1986) comeam a mover-se. Os leuccitos atrados ferida agora incluem mais moncitos, que colonizam o espao da ferida e seu redor; eles fagocitam os restos de neutrfilos, os quais continuam a chegar e a morrer horas depois de sua chegada. Conforme os macrfagos limpam, eles tornam-se ativados; eles secretam citocinas que direcionam a atividade de todas as outras clulas.

A rede de fibrina continua a crescer pelo fibrinognio fornecido pelo exsudato inflamatrio. Mecanicamente ele no muito forte, porm desempenha outro importante papel: filamentos de fibrina coagulados com a protena plasmtica fibronectina so adequadas como ponto de apoio para as clulas epidrmicas e fibroblastos migratrios. Aps 24 horas, os fibroblastos alargam-se e comeam a migrar em direo ao leito da ferida, arrastando-se ao longo dos filamentos de fibrina coagulados. Um desses fatores chamados de quimiotticos o PDGF, liberado pelas plaquetas no processo da hemostasia.

As clulas epidrmicas so mobilizadas dentro de horas. Clulas basais ao lado do corte, ativadas pela repentina ausncia de vizinhana (MONTESANO e ORCI em 1988 chamaram esse fenmeno de "efeito de vizinhana-livre"), deprimem-se e arrastam-se rea desnudada; as primeiras clulas ativadas so as fagocitrias, as quais devem ajud-las a digerir a regio abaixo e ao longo da crosta em formao.

A angiognese, que a regenerao de vasos sangneos, difcil de ser observada s 24 horas atravs de microscopia de luz, mas eles j esto se desenvolvendo em ambas faces da ferida, em resposta a fatores angiognicos, e crescem junto ao leito da ferida. A anoxia (falta de oxignio) o principal fator determinante do estmulo interno vascular. No leito da ferida a tenso de oxignio est prxima do zero: se isso aumentado artificialmente, a angiognese cessa (KNIGHTON et al., 1981). Essa fase de angiognese tambm se deve aos macrfagos. Eles migraram ao interior do leito da ferida tornando-se anxicos, e a anoxia incentivou-os a secretar um fator que estimula o crescimento capilar (KNIGHTON et al., 1983), provavelmente o TNFa (LEIBOVICH e WISEMAN, 1988). Este fator tambm secretado quando h altas concentraes de lactato, situao essa ocorrida no leito de feridas (JENSEN et al., 1986).

Devido grande variedade de fatores quimiotticos presentes na rea da injria, haver a atrao de determinadas clulas, por exemplo, aps as primeiras horas depois da agresso, neutrfilos infiltraro na rea na tentativa de limp-la de partculas e bactrias. Aps uma variao de 24 a 48 horas, tambm se observar uma presena macia de moncitos. Se uma excessiva contaminao ocorrer ou se houver a presena de partculas no passveis de sofrerem fagocitose nessa regio, a presena de neutrfilos, cuja principal funo liberar o tecido de fragmentos teciduais mortos e de microorganismos contaminantes, poder causar ainda mais dano ao tecido devido produo de enzimas e produtos citotxicos. Os moncitos sero ativados a estado de macrfago.

Os macrfagos tm varias funes. Eles debridam o tecido atravs da fagocitose e digesto de microorganismos patognicos, limpando a rea de tecido lesado e de neutrfilos efetores, desempenhando um papel crtico para o incio da reparao tecidual. Esses neutrfilos podero ainda ser fagocitados por fibroblastos (NEWMAN et al., 1992).

Quando o neutrfilo infiltra, o acmulo de moncitos continua, estimulado pelos fatores quimiotticos seletivos de moncitos. Esses fatores incluem fragmentos de colgeno, elastina e fibronectina; trombina enzimaticamente ativa e TGF-b . Similar ao recrutamento de neutrfilos, fatores quimiotticos ativam moncitos circulantes a aderir parede endotelial do vaso sangneo em direo ao interstcio da matriz extra celular. Os macrfagos tambm controlam a sntese e liberao de enzimas como a colagenase, por parte do fibroblasto (HUYBRECHTS-GODIN et al., 1979) que facilitam esse debridamento (CAMPBELL et al., 1987). Alm disso, quando os macrfagos so ativados por endotoxinas bacterianas, substncias como a protena neutrfilo-ativadora (NAP) so liberadas e facilitam o recrutamento de mais clulas inflamatrias ao local. Os macrfagos alm de promover fagocitose e debridamento, aderncia para matriz extra celular, tambm estimulam o moncito a sofrer uma metamorfose a macrfago inflamatrio/reparativo.

Dessa forma, os macrfagos desempenham um papel de suma importncia na transio entre a inflamao e a segunda fase da reparao das feridas, que a formao do tecido de granulao.

2.2.2.5. Cicatrizao: 3 dias

Em relao s clulas inflamatrias, aos dois ou trs dias, os moncitos comeam a exceder o nmero de neutrfilos (SIMPSON e ROSS, 1972). A regenerao, que havia comeado j s 24 horas da injria, agora domina o panorama. O avano de clulas epidrmicas faz-se entre a crosta sero-hemtica e o derma, por secreo de colagenase. Clulas basais normais no tem receptores para fibronectina enquanto que clulas em regenerao tem. A regulao depende, em grande parte, da extenso da crosta. Onde a epiderme estiver perfurada por uma linha de sutura, as clulas epidrmicas crescem para dentro da linha da sutura como um tubo circundando o fio. Isto deveria ser esperado, j que a tendncia de crescimento do epitlio sobre as superfcies teciduais expostas.

Os fibroblastos ativados esto em plena diferenciao. Em resposta aos fatores de crescimento eles multiplicam-se e produzem fibras colgenas, primeiramente colgeno do tipo III (McPHERSON e PIEZ, 1988). Eles tambm secretam proteoglicans e fibras elsticas.

A angiognese progride suficientemente para que aos dois ou trs dias, alguns brotos comecem a aparecer de ponta a ponta. A isso se conhece por inosculation (em latim sculo significa beijo, RUDOLPH e BALLANTYNE, 1990). Os novos fibroblastos acumulados misturam-se a novos capilares para formar o comeo do tecido de granulao. O tecido de granulao comea a ser formado por volta do quarto dia aps a injria (GUIDUGLI-NETO, 1987). Os vasos tm clulas endoteliais com caractersticas de forte ativao (GUIDUGLI-NETO, 1992).

O tecido de granulao consiste em um denso leito de macrfagos, fibroblastos e neovasos suportados por uma matriz de fibronectina, colgeno tipo I e tipo III e cido hialurnico. Os fibroblastos movem-se dentro do leito da ferida e ostentam diferentes fentipos. Primeiro os fibroblastos assumem um fentipo migrante, depois um fentipo produtor de colgeno e finalmente um fentipo contrtil, o miofibroblasto. Este o responsvel pelo fenmeno importante de contrao da cicatriz.

2.2.2.6. Cicatrizao Precoce: entre 7 e 10 dias

Dentro de uma semana o leito da ferida teve tempo suficiente para ser preenchido com tecido de granulao (GUIDUGLI-NETO, 1987). Muito pouco dele requerido devido ao fato de que os dois lados da ferida esto muito prximos. Uma rede de capilares atravessa o leito da ferida. A rede linftica comea a ser regenerada com algum atraso em relao `a rede vascular: eles avanam de ponta a ponta assim como os vasos sangneos. Lentamente o tecido de granulao adquire mais e mais fibras colgenas e comea adquirir a aparncia da massa fibrosa denominada "cicatriz".

De uma extremidade outra, a limpeza efetuada pelos macrfagos continua e eventualmente a fibrina tambm removida. O colgeno do tipo I comea a aparecer nessa fase (CLARK e HENSON, 1988).

Embora a epiderme tenha sido regenerada, os anexos da pele, como plos e glndulas, ainda no se desenvolveram. As cicatrizes em humanos geralmente so imberbes alm de plidas, devido a regenerao dos melancitos ocorrer pobremente.

2.2.2.7. Maturao da Cicatriz: entre 1 ms e 2 anos

Finalmente a cicatriz ser uma massa de tecido fibroso com muitas fibras colgenas, algumas clulas e alguns vasos, porm o processo de maturao lento. Conforme o tempo passa, a maioria das clulas desaparecem: observa-se apoptose dos fibroblastos e das clulas endoteliais (DARBY et al., 1990). Eosinfilos s vezes aparecem nas ltimas fases da reparao tecidual; talvez eles contribuam com fatores de crescimento (TODD et al., 1991). O colgeno tem cada vez mais pontes entre as fibras. Permanecem algumas fibras elsticas. Muitos capilares desaparecem e por isso as cicatrizes antigas tm aparncia esbranquiada, sendo hipo-vascularizadas.

A fase final da reparao de uma ferida a remodelao da matriz, que se solapa em parte com as fases predecessoras. Ou seja, a produo de matriz e sua remodelao produz-se simultaneamente com a formao do tecido de granulao. Entretanto, nos meses seguintes aps a reepitelizao, h uma reduo e alterao contnua da matriz. A fibronectina rapidamente eliminada da matriz e as fibras de colgeno tipo I aumentam lentamente ao longo da neomatriz para aportar resistncia pele e cicatriz

Todavia, tarda muitos meses, at mesmo um ano ou dois, para que uma cicatriz cirrgica mude de cor rosa para branca. A troca local de colgeno permanece alta durante anos.

A resistncia ao estiramento alterada na cicatriz. At mesmo uma cicatriz madura nunca to forte como a pele normal. A fora de tenso permanece abaixo do normal, nunca atingindo, na pele, a original. Em tecidos frouxos pode-se, contudo, atingir nveis superiores.

2.2.2.8. Mediadores Qumicos da Reparao Tecidual

Nas primeiras horas aps o estabelecimento de uma injria, os mediadores so aqueles pertinentes inflamao aguda. Por exemplo, mastcitos lesados liberam histamina que causa hiperemia, e uma variedade de clulas liberam prostaglandinas. Plaquetas do tampo hemosttico prontamente liberam serotonina (um vasoconstritor) e uma infinidade de outros mediadores. O aumento da permeabilidade de vnulas pode resultar da liberao de leucotrienos, liberado pelas plaquetas. Essas reaes ocorrem em cadeia: a coagulao acompanhada da ativao de calicreinas de origem plasmtica, as quais produzem bradicinina; a bradicinina induz a produo de prostaglandinas (WILLIAMS, 1988). Leuccitos so atrados pelo leucotrieno B4 e por muitos produtos da protelise. Enzimas proteolticas produzidas de diversas fontes (lisossomas de clulas e plaquetas lisadas, grnulos de mastcitos, plasmina do sistema fibrinoltico ativado), e elas atuam numa variedade de protenas para produzir mediadores (substratos incluindo molculas do complemento C3, C4, C5, cininognio e fibrina). Complementos, de qualquer forma, ajudam a atrair neutrfilos ainda que no sejam essenciais para a reparao tecidual (WAHL apud MAJNO e JORIS, 1996). Dentro de horas, os mediadores da inflamao aguda desaparecem e o papel principal desempenhado por uma variedade de citocinas e fatores de crescimento, especialmente o PDGF e o TNFa , secretado por macrfagos. Alguns desses fatores so liberados pelas plaquetas, especialmente nas primeiras horas, entretanto os mastcitos tambm os fornecem. Dentro de dois ou trs dias os macrfagos assumem a "vigilncia" do processo reparacional, parecendo ser a anxia um dos indutores principais.

Os fatores de crescimento implicados na reparao de feridas so inmeros, tm complexa ao e inter-relao uns com os outros, e ainda h controvrsia e falta de elucidao em relao a eles.

O termo "fatores de crescimento" deriva de seus efeitos estimuladores sobre a proliferao celular e a sntese de DNA in vitro. Eles constituem uma famlia de peptdeos reguladores com mltiplas e variadas funes. SPORN e ROBERTS, em 1988, afirmaram que os fatores de crescimento formam parte de uma complexa linguagem de sinais celulares em que os peptdeos individuais so o equivalente s letras de um alfabeto ou cdigo. ROTHE e FALANGA (1989) consideram que esses peptdeos desempenham um importante papel em muitos processos biolgicos in vivo, incluindo a embriognese, a oncognese e a reparao de feridas.

Os fatores de crescimento implicados diretamente na reparao tecidual e sua atividade biolgica esto resumidos nas tabelas 2.2 e 2.3 [segundo RIGAU, 1996].

Tabela 2.2: Fatores de crescimento implicados na reparao de feridas cutneas.
 
FATOR DE CRESCIMENTO
ORIGEM
ALVO
RECEPTOR
PDGF

PM:30.000

plaquetas
cel.endotelial
macrfagos
fibroblastos
cl. musc. lisa
cels. gliais
tirosina quinase
EGF

PM:6.045

gl. Brunner
gl. submaxilar
queratincitos
cl. endotelial
fibroblastos
tirosina quinase
IGF-I

PM:7.800

fibroblastos
hepatcitos
fibroblastos
queratincitos
hepatcitos
tirosina quinase
IGF-II

PM:7.471

fibroblastos

hepatcitos

queratincitos
fibroblastos
hepatcitos
adipcitos
tirosina quinase
TGFa

PM:5.700

cl. epitelial

cels. tumorais

macrfagos

queratincitos
hepatcitos
fibroblastos
osteoblastos
cels. Schwann
tirosina quinase
TGFb

PM:25.000

plaquetas queratincitos
hepatcitos
fibroblastos
osteoblastos
3 receptores

alta afinidade

afgf

Pm:15.600

crebro

retina

cl. endotelial
fibroblastos
condrcitos
cels. gliais
cels. epiteliais
osteoblastos
queratincitos
PM:150.000
bgf

Pm:16.400

crebro
retina
corpo lteo
macrfago
rim

prstata
tireide

cels. endoteliais
fibroblastos
condrcitos
cels. gliais
cl. epitelial
osteoblastos
queratincitos
alta afinidade

sem endocitose

do complexo

FGF-FGF-R

Tabela 2.3: Atividade biolgica dos fatores de crescimento implicados na reparao cutnea.
 
FATOR de CRESCIMENTO
Atividade Biolgica
PDGF
  • vasoconstrio
  • modulador da sntese de componentes de matriz extracelular
  • aumenta proliferao de fibroblastos, cels. da musc. lisa e cels. gliais 
  • ativao de fosfolipases
 
EGF
in vitro
  • aumenta proliferao de queratincitos e cels. endoteliais
  • aumenta a sntese de GAGs
  • favorece a unio EGF - EGF-R
  • aumenta a produo de IGH
in vitro
  • favorece a hiperplasia e hipertrofia
 
IGF
  • modula a proliferao de queratincitos
  • aumenta a sntese de fosfatidilcolina
  • diminui o catabolismo protico
  • inibe a glicognese em adipcitos 
 
TGF
  • regula a proliferao cl. e sntese de componentes de matriz extra celular
  • diminui o crescimento de queratincitos e fibroblastos
  • favorece a formao de queratina
  • aumenta a proliferao de fibroblastos e osteoblastos
  • imunossupressor de linfcitos T
 
FGF
in vitro
  • atua como um fator de concorrncia
  • intervm na morfologia, proliferao e diferenciao celular
  • potente mitgeno para mesoderma e cels. derivadas
  • modula a proporo relativa dos tipos de colgeno sintetizado pelo endotlio vascular
  • substituto da matriz extra celular na regulao da diferenciao das cels. mesodrmicas
 

2.2.3. Cicatrizao por Segunda Inteno

A reparao tecidual pode ser retardada em duas circunstncias: se a ferida for contaminada ou se a ferida for aberta.

2.2.3.1. Cicatrizao de Feridas Infectadas

Na superfcie exposta de uma ferida infectada, ocorrem ondas de neutrfilos. Mesmo se a ferida estiver suturada, as superfcies justapostas no podem se aderir umas s outras, devido ao fato de elas estarem separadas por pus. Eventualmente, as duas superfcies so cobertas por uma camada de tecido de granulao similar membrana piognica de um abscesso, produzindo pus. De fato, uma ferida infectada comporta-se muito mais como um abcesso bem delimitado. A reparao no pode comear at que a infeco tenha sido superada; naquele ponto da ferida, preenchido parcialmente por tecido de granulao, tornar-se- uma ferida aberta. Dessa forma o processo de cura dessa ferida evoluir de maneira especial. A presena de neutrfilos, trazendo grande quantidade de enzimas lticas, e a alterao do pH, comprometem o adequado crescimento celular.

2.2.3.2. Cicatrizao de Feridas Abertas

A reparao de uma ferida aberta, cirrgica (excisional) ou acidental, apresenta um problema especial devido sua perda de substncia, que de alguma forma deve ser preenchida. O organismo capaz de sintetizar algum preenchimento, como o tecido de granulao, porm tem um mecanismo coadjuvante mais rpido. Aps um perodo que varia entre cinco e nove dias, as margens da ferida movem-se uma contra a outra, como se houvesse uma fora invisvel de trao (PEACOCK, 1984). Este fenmeno conhecido por "contrao da ferida". Embora presente em qualquer cicatrizao, a maior quantidade de tecido de granulao far com que o fenmeno ocorra de maneira quantitativamente mais exuberante.

Essa contrao de feridas abertas feita por pelo menos dois mecanismos distintos. Durante os primeiros dias, numa ferida aberta no coberta com um curativo mido, a crosta que contrai. A crosta consiste principalmente de fibrina seca. Quando ela sca ela se contrai, e estando firmemente ancorada no tecido de baixo, ela pode reduzir a superfcie de uma ferida pequena aberta.

Outro mecanismo de contrao comea a acontecer aps cerca de uma semana, um estiro mecnico muito forte. Isso ocorre porque as feridas, abertas ou no, contm clulas capazes de contrair-se. Essas clulas so conhecidas por miofibroblastos.

2.2.3.3. Participao dos Miofibroblastos

Os miofibroblastos so fibroblastos que se diferenciam para agir na contrao da ferida assumindo um fentipo contrtil. Uma vez executado seu papel, eles se desdiferenciam e voltam a ser fibroblastos.

Se fibroblastos isolados tornam-se mais curtos, o tecido circundante no ir contrair de todo. Ento, na diferenciao a miofibroblasto, eles desenvolvem estruturas peculiares que seriam esperadas de clulas desenhadas para puxar (GABBIANI apud MAJNO e JORIS, 1996). So elas: fibrilas intracelulares com densidade corprea semelhante msculos lisos; microtendes, nome que MAJNO e JORIS preconizam para feixes fibrosos que emergem das clulas, em continuidade a direo de fibrilas intracelulares ("fibronexus" o nome oficial para esse arranjo); junes intracelulares de vrios tipos, especialmente junes do tipo gap; que no so vistas habitualmente entre os fibroblastos ordinrios. De fato, fibroblastos normais no esto em contato uns com os outros. Todas essas modificaes levam o miofibroblasto a assemelhar-se, mas no a tornar-se, uma clula muscular lisa.

Os miofibroblastos so clulas intermedirias entre fibroblastos e clulas musculares lisas, porm o mecanismo de utilizao de seu "maquinrio contrtil" ainda no est inteiramente esclarecido. Eles parecem exercer esse estiro de duas diferentes maneiras (MAJNO e JORIS, 1996):

  • Por encurtamento, como fazem as clulas musculares. Como os fibroblastos esto conectados tanto uns aos outros como ao estroma, se cada um tornar-se menor, o resultado em toda a extenso ser similar quele do msculo contraindo-se.
  • Por um mecanismo estacionrio (HARRIS et al., 1980). Este mecanismo, ainda hipottico, pode ser entendido se imaginarmos um marinheiro puxando uma ncora. O marinheiro faz trao, entretanto no tem como mover-se nesse processo. Este conceito foi sugerido devido ao fato de que fibroblastos em cultura (miofibroblastos) cultivados em um gel de colgeno, so capazes de contrair esse gel.
Pouco se sabe dos mensageiros que induzem a diferenciao de fibroblastos a miofibroblastos. Seguramente h algo nas feridas abertas que induzem essa modulao.

Os miofibroblastos alinham-se ao longo de novos depsitos de matriz extra celular no eixo axial da ferida, formando unies de clula clula e de clula matriz para gerar posteriormente foras de tenso da ferida produzindo a contrao de si mesma.

A reparao de mucosas mais rpida que a de pele, mostrando que muitos dos relatos experimentais que foram realizados em pele devem ser extrapolados para outros locais com cuidado.

Observamos que a reparao tecidual envolve mecanismos complexos que abrangem eventos locais e sistmicos; mecnicos, qumicos e bioqumicos; onde interferem vrios fatores como tipo de ferida, sua extenso, tipo e quantidade de clulas lesadas alm de condies sistmicas do paciente, bem como seu estado nutricional e imunolgico. O laser de baixa potncia portanto, tem diferentes aes segundo o momento da reparao e o tipo de paciente em que o estamos utilizando como terapia. Para analisarmos seus efeitos planejamos isolar parcialmente esses eventos, fazendo a reviso da ao do laser in vivo e in vitro, e buscando dessa forma elucidar o porque dessa terapia clinicamente manifestar-se por melhor tempo reparacional e melhor qualidade da cicatriz formada em pacientes submetidos a ela.

2.3. Reviso dos Efeitos do Laser na Cicatrizao in vivo

2.3.1. Introduo

Os estudos in vivo em animais de laboratrio bem como estudos clnicos em pacientes apoiam a teoria de que a regenerao tissular e a cicatrizao de feridas so favorecidas quando tratadas com laser de baixa potncia. Desde que MESTER (1966), nos anos 60, publicou seus primeiros resultados no tratamento de lceras crnicas com laser de rubi operando em baixa intensidade de energia, foram publicados estudos e efeitos desse tipo de terapia com laser tanto em clnica humana como em animais, alm de inmeros trabalhos in vitro.

Ao princpio refletiam casos pontuais ou experincia de alguns poucos clnicos cuja casustica apresentada era pequena e pouco significativa. Alm disso a metodologia empregada nesses estudos era de pouca qualidade cientfica e contestvel em termos da casustica apresentada, havendo uma variedade enorme de parmetros de irradiao e modelos de trabalho. Pouco a pouco foram aparecendo trabalhos seguindo uma metodologia mais adequada e homognea alm de parmetros mais reproduzveis e menos passveis de contestao. Estudos a duplo cego e seguimentos a longo prazo comearam a dar mais qualidade e subsdio aos resultados obtidos nessas pesquisas.

A maioria das publicaes in vivo apresentavam estudos em animais e humanos tratados com laser de baixa potncia demonstrando sua ao sobre a sntese e remodelao de colgeno, nmero de fibroblastos, dimetro e fora de trao das feridas tratadas, viabilidade dos enxertos tratados, vascularizao, vasodilatao, sistema linftico, efeito antibacteriano e imunolgico, seus efeitos sistmicos, e apenas alguns poucos estudos acerca da ao dessa terapia sobre o tecido periodontal, ou sobre sua ao diretamente em enfermidades associadas prtica odontolgica (RIGAU, 1996).

MESTER produziu uma srie de trabalhos desde meados da dcada de 60 (1966, 1969, 1971a, 1971b, 1971c, 1972, 1973a, 1973b, 1973c, 1974, 1975, 1977, 1978, 1982, 1984) at sua morte, em 1984 e concluiu que o laser de baixa potncia acelerava a diviso celular. Observou em seus trabalhos feitos ao longo desses anos, um significativo aumento dos leuccitos que participavam na fagocitose e maior sntese de colgeno por parte dos fibroblastos tratados. Alm disso observou que havia uma regenerao mais precoce de vasos linfticos nos grupos tratados, o que o levou a concluir que facilitava o desenvolvimento do tecido de granulao.

O mais importante efeito do laser de baixa potncia sobre a cicatrizao de feridas foi o aumento da sntese de colgeno por parte dos fibroblastos, demonstrado nos experimentos onde monitorou-se essa sntese utilizando microscpio eletrnico para o controle da captao de prolina e glicina tritiada (RIGAU, 1996). Os efeitos observados fora da rea tratada, foram atribudos por MESTER (1974) e TRELLES (1983) a fatores humorais. Mediante esse importante postulado os autores preconizaram que no tratamento no seria necessrio irradiar toda a rea lesada para obter um efeito uniforme em toda a zona. Baseados nessa teoria, RODRIGO et al., em 1985, publicaram um estudo sobre o efeito do laser de He-Ne no tratamento de fstulas osteomielticas mltiplas de ratos fmeas, onde obtiveram a cura de todas elas no corpo, irradiando apenas uma nica pata do animal.

Essa foi uma importante descoberta j que dessa forma surgiu uma possvel resposta s dvidas que apareceram quando equipes como as de KANA (1981), HUNTER (1984), BASFORD (1986) e SAPERIA (1986), em diferentes tipos de experimentos, no conseguiram resultados positivos na cicatrizao de feridas padronizadas em animais de experimentao. Em todos esses experimentos, porm, os autores utilizaram o mesmo animal para estudar feridas irradiadas e no irradiadas. Ou seja, no mesmo animal utilizaram uma rea com feridas no irradiadas como grupo controle e em outra rea do mesmo animal, eram produzidas feridas que recebiam o tratamento e portanto eram irradiadas. Ainda assim, autores da equipe de SILVEIRA, pioneiro em pesquisas na rea do laser de baixa potncia no Brasil, em 1991, estudaram alguns aspectos do comportamento de mastcitos quando se irradiava cobaias com um diodo laser operando em 904 nm utilizando como modelo de estudo feridas em cobaias, sendo a ferida controle e a ferida irradiada no mesmo animal, e observaram que havia maior degranulao de mastcitos, alm de maior proliferao fibroblstica e aumento da substncia fundamental do tecido conjuntivo nas feridas irradiadas em relao as controle, mesmo estas sendo no mesmo animal.

Outro grande pesquisador nessa rea foi ABERGEL e em 1988 ele e sua equipe fizeram um estudo sobre feridas padronizadas usando como modelo pele de porcos onde compararam o efeito do laser de He-Ne e de uma lmpada de tungstnio sobre a cicatrizao tecidual. Realizaram um seguimento fotogrfico para verificao da fora de tenso e da evoluo do dimetro da rea da ferida tratada. Concluram que houve resultado positivo de at 94% nas feridas tratadas com laser de baixa potncia. Ainda assim, STRUBE et al. (1988), no mesmo ano, publicaram um artigo onde fizeram um experimento similar a esse e obtiveram resultados negativos. Outros autores como HALL et al., em 1994, e CHELYSHEV e KUBITSKY, em 1995, tambm no conseguiram observar nenhum tipo de efeito dessa terapia sobre a cicatrizao tecidual, muito embora o primeiro autor trabalhasse com fluncias extremamente inferiores quelas preconizadas na literatura, e os segundos trabalhassem com regenerao de axnios mielinizados, modelo de estudo de natureza muito diferente queles preconizados e utilizados na literatura, desde a dcada de 60.

2.3.2. Estudos in vivo

2.3.2.1. Efeitos Sistmicos

Vrios autores como MARTINEZ et al. (1984), LEUNG et al. (1985), RODRIGO et al. (1985), SMITH-AGREDA et al. (1985; 1986), SARTI et al. (1995) e VILLAPLANA et al. (1995) tm estudado os efeitos do laser de baixa potncia sobre as funes endcrinas, principalmente sobre clulas em cultivo e em tecidos de pequenos roedores. Esses estudos utilizavam lasers emitindo na regio do visvel, como o He-Ne, e lasers emitindo no infravermelho prximo, com diferentes comprimentos de onda, e em todos eles, nos grupos irradiados foram estimuladas as funes endcrinas e a diviso celular. Nos grupos irradiados as clulas tireoideanas e hipofisrias mostraram incremento de sua atividade aps irradiao da adenohipfise. Esses resultados nos levam a deduzir os possveis efeitos sobre glndulas secretoras. Esses autores recomendavam evitar a irradiao clnica em humanos diretamente sobre zonas glandulares, ainda que no houvesse nenhuma evidncia clnica de que esse tipo de laser pudesse produzir hiperfuno glandular. Por isso, nos primeiros livros referentes terapia com laser de baixa potncia, autores como CISNEROS & TRELLES em 1987, sugeriam como contra-indicao, a irradiao clnica direta de glndulas.

Outro grande autor que vem contribuindo muito em esclarecer os mecanismos bsicos de ao desse tipo de laser ROCHKIND, que com outros autores em 1989 publicaram um estudo sobre os efeitos sistmicos do laser de He-Ne comparando trs diferentes tipos de modelos experimentais em rato. Observaram a evoluo de feridas cutneas provocadas por queimaduras padronizadas, por injria do sistema nervoso perifrico e por injria do sistema nervoso central nesses animais. Dividiram esses trs modelos em dois grupos. Os animais receberam duas feridas, uma de cada lado da espinha dorsal. Um grupo foi o controle e no recebeu irradiao laser e o outro grupo recebeu irradiao apenas em uma das feridas. Ambas feridas, irradiada e no irradiada, foram curadas em tempo significativamente inferior quando comparadas ao grupo controle no irradiado e no apresentaram diferena estatisticamente significante entre si. Os mesmos autores descreveram os efeitos positivos e sua persistncia a longo prazo. Tambm demonstraram efeitos negativos quando se utilizou alta irradincia (200 mW/cm2).

Nessa mesma poca, TRELLES et al. (1988) publicaram um estudo feito em sangue e lnguas pulverizadas de rato, que haviam sido irradiadas com fluncia de 2,4 J/cm2. Eles analisaram os nveis de histamina detectados em ambos modelos. Utilizaram dois protocolos: no primeiro trabalharam com um laser de 4 mW de potncia de sada e no segundo com um laser de 50 mW. Em sangue no observaram alteraes significativas entre os grupos irradiados e controle. Em lngua, entretanto, o grupo irradiado com laser de 50 mW de potncia de sada apresentou aumento de 30% de histamina em relao ao grupo controle, e no grupo irradiado com laser de 4 mW obteve-se aumento de 100% no nvel de histamina em relao ao grupo controle.

Com base nesses resultados, os mesmos autores (TRELLES, 1989a e 1989b) realizaram um seguimento microscpio, com cortes semifinos e a nvel ultraestrutural de lnguas de rato irradiadas, e observaram degranulao de mastcitos significativamente aumentada nos grupos irradiados.

Em 1990, EL SAYED e DYSON realizaram um estudo em pele s e lesada utilizando lasers emitindo seis diferentes comprimentos de onda com fluncia de 10,8 J/cm2. Fizeram um seguimento observando a degranulao e o nmero de mastcitos nesses grupos. Demonstraram que em pele s e irradiada, produziu-se um aumento do nmero de mastcitos porm sem sua degranulao. Em pele lesada, produziu-se um aumento do nmero de mastcitos bem como sua respectiva degranulao.

Os parmetros de trabalho dos grupos foram diferentes. A equipe de El Sayed utilizou fluncia 4 vezes maior que a equipe de TRELLES e ambos utilizaram diferentes tcnicas para anlise dos mastcitos. O modelo tambm influenciou bastante, j que o primeiro foi em mucosa enquanto que o segundo foi em pele, e ambos so muito heterogneos do ponto de vista ptico. Tambm utilizaram irradincias diferentes, fato esse que foi significativo inclusive entre os diferentes grupos irradiados no primeiro experimento do grupo de TRELLES. Em 1996, RIGAU, da equipe desse autor, observou a respeito desses experimentos, que os mastcitos e os mediadores biologicamente ativos que so liberados durante a degranulao, so elementos chave durante a primeira fase inflamatria da cicatrizao de feridas, tanto no papel que desempenham na permeabilidade vascular como na liberao de substncias que influenciam na regulao da migrao linfocitria e na adeso molecular das clulas endoteliais a partir dos capilares venosos. Tambm observou sua importncia nos processos imunolgicos nvel cutneo, como demostrado nos experimentos de KAMINER et al., 1991; VAN NESTE, 1991 e REICH et al., 1991.

Em 1997, SASAKI e OHSHIRO fizeram um estudo sobre os efeitos de um diodo laser operando em 830nm na reparao tecidual utilizando modelo em pele de ratos. Utilizaram 20 animais onde fizeram feridas padronizadas e irradiaram com laser de 60 mW de potncia de sada com fluncia de 24 J/cm2, diariamente, durante 7 dias. Avaliaram alteraes de citocinas, particularmente a interleucina-6 (IL-6), por ser a mais tpica e a de mais fcil deteco. Os autores observaram que houve diferena significativamente maior na quantidade de citocinas no grupo irradiado, sobretudo no ps-operatrio de 2 dias, alm de histologicamente haver um melhor controle inflamatrio. Tambm observaram que nos grupos irradiados houve grande nmero de neutrfilos e que apareceram mais cedo nos tecidos subcutneos em relao ao grupo controle, e que igualmente desapareceram mais rapidamente. Os autores concluram que o laser de baixa potncia induziu mais rapidamente fase proliferativa e aumentou os nveis de IL-6.

Em 1999, STADLER et al., estudaram os efeitos sobre linfcitos de um laser de Argon:Dye emitindo na regio do visvel e operando em 660 nm e de um diodo laser emitindo na regio do infravermelho prximo operando em 830 nm. Os autores irradiaram linfcitos em suspenso com fluncias diferentes, variando entre 0 e 5 J/cm2, na presena e ausncia de eritrcitos. A irradiao com o primeiro diodo laser, na presena de eritrcitos, aumentou significativamente a resposta de proliferao dos linfcitos, sendo a resposta mxima detectada com fluncia de 3 J/cm2. Para o segundo diodo laser, o mximo de interao ocorreu com fluncia de 1,5 J/cm2. Os autores observaram que na ausncia de eritrcitos, o efeito da irradiao mostrou uma fraca relao dose-resposta.

2.3.2.2. Efeitos Locais

Em 1982, DYSON e YOUNG demonstraram que um diodo laser emitindo na regio do infravermelho prximo e com radiao pulsada e freqncia de 700 Hz acelerou a formao de tecido cicatricial enquanto que o mesmo diodo laser, com freqncia de 1200 Hz, no demonstrou ser efetivo quando no houve alterao em nenhum outro parmetro de irradiao.

Em 1984, TRELLES e MESTER, publicaram um estudo clnico em pacientes portadores de lceras vasculares de membros inferiores, onde as irradiaram com laser de He-Ne com fluncia de 4 J/cm2. Os autores realizaram um seguimento fotogrfico e nvel microscpico da evoluo dessas feridas, observando melhor evoluo do tecido de granulao, bem como da neo-vascularizao e da epitelizao dos grupos tratados com laser em relao aos grupos controles.

Em 1987, ABERGEL et al. publicaram um estudo dos nveis intracelulares de RNAm-procolgeno tipo I e tipo III presentes em feridas irradiadas com laser de He-Ne, comparando um grupo controle e um grupo irradiado com uma luz de tungstnio. Aps 10 dias de tratamento no foram observadas alteraes significativas. Aos 17 dias observou-se uma diferena no RNAm-procolgeno tipo I que aos 28 dias foi estatisticamente significativa. O RNAm-procolgeno tipo III aumentou aos 10 dias e foi significativo aos 17 e 18 dias.

Em 1988, TERRIBILE et al. fizeram um estudo utilizando um laser de He-Ne e um diodo laser emitindo no infravermelho prximo onde apresentaram um seguimento analisando o dimetro das feridas, o material depositado no fundo e na superfcie delas, seu grau de contrao e de repitelizao, a presena de fibras reticulares, de colgeno e elastina, alm de material PAS positivo (presena de glicosaminoglicans) que foi produzido. Concluram que tanto o laser de He-Ne como o diodo laser levaram a uma diminuio do tempo de epitelizao e houve aparecimento mais precoce de material PAS positivo, favorecendo a cicatrizao.

Em 1989, YEW et al. estudaram, por meio de microscopia de transmisso, a cicatrizao em anastomoses intestinais tratadas com laser de He-Ne. Concluram que houve maior sntese de colgeno nas suturas dos animais dos grupos tratados com laser.

Em 1989, BIHARI. e MESTER apresentaram um estudo clnico em pacientes portadores de lceras. Os autores trabalharam com trs grupos. Um grupo foi irradiado com laser de He-Ne, outro com a associao de laser de He-Ne e um diodo laser emitindo na regio do infravermelho prximo e outro com uma luz no-coerente, cujo comprimento de onda foi de 632 nm. Em todos os grupos a fluncia utilizada foi de 4 J/cm2. Os autores demonstraram a eficcia teraputica da associao dos diferentes tipos de lasers, que demonstraram melhores resultados quando comparados aos demais grupos.

Em 1989, o filho de Endre Mester, Andre MESTER, que aps a morte de pai manteve sua linha de pesquisa, publicou um seguimento clnico de 2167 pacientes portadores de lceras cutneas ou de mucosas, confirmando que a fluncia ideal para a terapia desse tipo de lceras era de 4 J/cm2, fluncia essa que j havia sido preconizada como ideal por seu pai em 1966 (MESTER, 1966).

Em 1990, ENWEMEKA et al. realizaram um seguimento da cicatrizao de tendes de Aquiles aps sua inciso cirrgica. A irradiao realizou-se transcutaneamente, com laser de He-Ne. Os autores observaram o nmero de fibroblastos e de fibras colgenas e concluram que foram mais abundantes e seguiram um bom alinhamento no eixo longitudinal nos tendes irradiados em relao aos controles no irradiados.

Em 1991, TSUCHIDA et al. trataram feridas cirrgicas de ratos normais e diabtico-induzidos com laser de He-Ne com scanner e com fluncia de 4 J/cm2. Fizeram um estudo do seguimento da velocidade de fechamento dessa feridas e observaram que as feridas tratadas com laser fecharam antes, tanto nos animais normais como nos diabticos, quando comparados a seus respectivos grupos controles.

Em 1991, outro grande pesquisador dos mecanismos bsicos da ao desses tipos de lasers, LIEVENS, publicou um de seus belos experimentos onde estudou o seguimento da cicatrizao de feridas, avaliando o nvel de adeso a planos inferiores, o grau de edema local, bem como a regenerao do sistema venoso e linftico. Aps a anlise detalhada dos resultados concluiu que a adeso aps quatro dias da implantao da ferida foi de 100% nos grupos controle no irradiados, enquanto que nos grupos irradiados no foi significativo. Aps 8 dias o edema havia desaparecido nesses grupos, persistindo naqueles. Seis meses depois, a permeabilidade dos vasos sangneos e linfticos foi de 50% mais nos irradiados em relao aos controle. RIGAU, em 1996, sugeriu que a explicao disso seria pela resposta diferenciada dos mastcitos presentes nos tecidos irradiados com laser de baixa potncia.

Em 1991, IN DE BRAEKT et al. provocaram feridas em palato de ces da raa beagle e tatuaram pontos de ambos os lados das feridas para observar seu grau de contrao durante a cicatrizao. Usaram um diodo laser emitindo no infravermelho prximo com fluncia de 1 J/cm2. Fizeram a irradiao trs vezes por semana, durante trs semanas, e no observaram alteraes significativas em relao ao grupo controle no irradiado.

Em 1992, TERRIBILE et al. estudaram a evoluo de feridas padronizadas em dorso de ratos fmeas tratados com um laser de He-Ne e uma luz halgena no coerente, que foi filtrada para obter o comprimento de onda de 633 nm. Utilizaram fluncia de 3,6 J/cm2. Observaram que a velocidade de fechamento da ferida foi muito maior e estatisticamente significativa nos grupos irradiados com luz coerente (laser de He-Ne) em relao aos grupos controle e irradiados com luz no coerente.

Em 1992, SMITH et al. fizeram um estudo em pequenos roedores onde controlaram a sobrevivncia de retalhos comparando a utilizao de um diodo laser e uma luz no coerente. A irradiao foi feita sobre a rea receptora, cinco dias antes de receber o retalho e cinco dias aps a interveno cirrgica. No observaram alteraes significativas.

Ainda em 1992, KUSAKARI et al., estudaram os efeitos do laser de baixa potncia em cicatrizao de gengiva e na reparao ssea. Pela primeira vez foi publicado um artigo in vivo especfico em odontologia. Os autores fizeram o estudo em duas partes. Na primeira fizeram um seguimento in vivo e outro in vitro. Trabalharam com ces adultos, onde fizeram perfuraes mandibulares e as irradiaram. In vitro trabalharam com osteoblastos da linhagem UMR 106 em cultivo e incorporaram timidina tritiada, aps a irradiao. Para ambos experimentos utilizaram um diodo laser operando em 780 nm e com potncia de sada de 30 mW. Na segunda parte do estudo, removeram dentes de ces adultos e implantaram cilindros de titnio, irradiaram os animais com um diodo laser operando em 810 nm e com potncia de sada de 60 mW. Observaram que o laser estimulou a sntese de DNA e a expresso de ALP-atividade nas clulas osteoblsticas in vitro. In vivo observaram que os grupos irradiados tiveram maior recobrimento na perda ssea, alm de melhor cicatrizao gengival.

Em 1993, LEE e KIM fizeram feridas em ratos e injetaram Stafilococcus aureus para contamin-las. Um grupo recebeu tratamento dessas feridas que foram irradiadas com um diodo laser emitindo na regio do infravermelho, enquanto que o grupo controle no recebeu nenhum tipo de tratamento. Os autores observaram uma boa evoluo das feridas tratadas em comparao aos grupos controles.

Em 1994, NOGUEROL et al. estudaram as alteraes ultraestruturais periodontais em ratos aps sua irradiao com um laser de He-Ne, por meio de microscopia eletrnica de varredura. Os animais foram divididos em trs grupos: um irradiado com fluncia de 10,5 J/cm2, outro irradiado com fluncia de 51,5 J/cm2, e outro controle no irradiado. Os animais foram sacrificados imediatamente e aos 10 dias aps a irradiao. Os autores observaram que nos grupos irradiados com fluncias mais altas, houve maiores alteraes celulares no epitlio, duas diferentes populaes de fibroblastos presentes no tecido conjuntivo bucal, alm de duas diferentes subpopulaes de ostecitos.

Em 1994, ZHANG e AL-WATBAN publicaram um estudo em ratos onde fizeram feridas padronizadas para comparar a cicatrizao de feridas tratadas com laser de He-Ne e de He-Cd (l = 442 nm), utilizando fluncias variveis de 1, 4, 7 e 11 J/cm2, com irradiaes 3 vezes por semana. A cicatrizao foi mais rpida e de melhor qualidade para os grupos tratados com o laser de He-Ne. Os autores observaram que esse comprimento de onda apresentou maior penetrao e transmisso e menor absoro e espalhamento (scattering) que o comprimento de onda emitido pelo laser de He-Cd. No mesmo ano (AL-WATBAN e ZHANG, 1994) os autores trabalharam com esse mesmo modelo animal, e utilizaram um laser de He-Ne, porm com diferentes parmetros de irradiao para os grupos tratados. As irradiaes variaram entre 3 e 5 tratamentos por semana, a fluncia utilizada foi de 25 J/cm2 para um grupo e de 7 J/cm2 para outro grupo. Observaram que variando a irradincia (de 3,7 a 15,9 mW/cm2) enquanto mantinham a fluncia constante, no havia alterao significativa. Os resultados mostraram ser dependentes da fluncia e freqncia do tratamento. Quando o tratamento foi dado por mais de 5 dias numa mesma semana, obteve-se um efeito inibitrio sobre a cicatrizao. No ano seguinte, em 1995, os autores publicaram um estudo baseado num protocolo parecido ao anteriormente relatado, porm utilizaram um laser de Argnio, operando com baixa intensidade de energia. Observaram um efeito inibitrio desse laser quando utilizaram alta fluncia (de 130 a 150 J/cm2) na irradiao (AL-WATBAN e ZHANG, 1995). Um ano depois, ainda seguindo essa linha de pesquisa, AL-WATBAN e ZHANG (1996) fizeram um estudo com o mesmo modelo animal utilizando lasers emitindo diferentes comprimentos de onda. Usaram diferentes lasers: laser de He-Cd (l = 442 nm), Argnio (l = 488 e l = 514 nm), He-Ne (l = 632,8 nm) e dois diferentes diodos lasers de As-Ga-Al (l = 780 nm e l = 830 nm). Para todos eles trabalharam com uma fluncia de 20 J/cm2. Observaram que houve diferena significativa entre os grupos controle no irradiados e os irradiados. Entre os laseres utilizados, o laser de He-Ne foi o mais efetivo. Ainda em complementao, os autores fizeram a monitorao da temperatura durante a irradiao com os diferentes tipos de laser, porm no houve alterao significativa dela em nenhum grupo irradiado quando comparado ao controle.

Em 1995, KAMEYA et al. apresentaram um estudo em ratos onde irradiaram feridas padronizadas nesses animais com diodos lasers emitindo diferentes comprimentos de onda (l = 632,8; 680; 830 nm). Observaram diferenas macroscpicas significativas nos grupos irradiados em relao aos controle, embora no fossem estatisticamente significante entre os diferentes grupos irradiados. Histologicamente observaram que os trs grupos irradiados apresentaram maior proliferao de tecido conjuntivo e maior presena de vasos sangneos quando comparados aos grupos controle.

Em 1995, GMEZ-VILLAMANDOS et al. apresentaram um bonito estudo feito em eqinos, onde por via fibroendoscpica, trataram leses ulcerosas na mucosa respiratria desses animais com um laser de He-Ne. Observaram que a cicatrizao aconteceu mais rapidamente nos animais tratados com laser e que, histologicamente, o tecido estava melhor vascularizado, com menos edema e com tecido conectivo mais ativo quando comparados aos grupos controle.

Em 1996, EL SAYED e DYSON estudaram os efeitos do pulso de repetio e a importncia do seu tempo de durao, com um diodo laser operando em 820 nm, sobre mastcitos de ratos. Os autores queriam determinar os parmetros ideais de uso desse tipo de laser para aumentar o nmero de mastcitos locais bem como sua degranulao. Para isso usaram um mesmo comprimento de onda com diferentes freqncias de pulso, em modelo de feridas padronizadas em pele de rato. Verificaram que o aumento do nmero de mastcitos no dependeu da freqncia de pulso, porm a degranulao sim.

Em 1997, GMEZ-VILLAMANDOS et al., seguindo sua linha de pesquisa em eqinos, fizeram um estudo sobre os efeitos do laser de He-Ne e de um diodo laser de As-Ga operando em 904 nm na cicatrizao de leses superficiais em mucosa de cavalos. Os autores produziram feridas padronizadas e as irradiaram com aplicaes dirias, durante 15 dias, com fluncia de 8 J/cm2. Os resultados micro e macroscpicos mostraram que nos grupos irradiados, alm dos animais apresentarem cicatrizao mais rpida, nenhum animal desenvolveu infeco, fato esse evidencivel em 70% dos animais dos grupos controle.

Em 1997a, WEI YU et al., utilizaram um laser de Argnio operando em 630 nm sobre feridas padronizadas em ratos geneticamente diabticos para verificao de seus efeitos na cicatrizao. Os autores dividiram os animais em 4 grupos. O grupo 1 foi utilizado como controle negativo, o grupo 2 como controle positivo (foi aplicado topicamente fator de crescimento fibroblstico local - bFGF sobre a ferida), o grupo 3 foi irradiado com laser e no grupo 4 foi utilizada a associao laser de baixa potncia e aplicao tpica de bFGF. Para a anlise dos resultados foi utilizada a evoluo histolgica e a velocidade de fechamento da ferida. Os autores observaram que clinicamente os grupos que tiveram as feridas fechadas mais rapidamente foram aqueles que receberam apenas irradiao laser, e histologicamente os animais desses grupos tiveram melhor e mais rpida epitelizao, bem como formao de tecido de granulao e deposio de colgeno.

No mesmo ano, TANG et al. estudaram as alteraes morfolgicas que ocorreram em fibras de colgeno de ratos tratados com diodo laser operando em 830 nm. Trabalharam com fluncia varivel, de 400 a 550 J/cm2 e irradincia fixada em 250 W/cm2. Os autores observaram, por meio de microscopia ptica e de eltrons, alteraes morfolgicas nas fibras de colgeno dos animais irradiados. Os autores concluram que essa alterao da morfologia espacial das fibras poderia explicar parcialmente a ao do laser de baixa potncia na cicatrizao tecidual.

Em 1998, REDDY et al., fizeram um estudo sobre os efeitos da foto-estimulao laser sobre a produo de colgeno em tendo de Aquiles de coelhos. Os autores lesaram esses tendes e imobilizaram as patas dos animais com talas de poliuretano. O tratamento foi feito com laser de He-Ne, com aplicaes dirias, usando fluncia de 1 J/cm2 durante 14 dias consecutivos. As anlises bioqumicas dos tendes revelaram 26% de aumento na concentrao de colgeno, indicando um processo de cicatrizao mais rpido dos tendes dos animais irradiados, quando comparados aos do grupo controle no irradiado.

Em 1998, MORRONE et al., publicaram um estudo sobre a ao de um diodo laser de Ga-Al-As sobre trauma muscular. Os autores prensaram msculos de pata posterior de coelhos adultos e irradiaram com um diodo laser operando em 780 nm, com diferentes parmetros de irradiao. Os animais foram divididos em 4 grupos. O grupo 1 foi usado como controle, o grupo 2 foi tratado com fluncia de 150 J/cm2 e freqncia de 50 Hz, o grupo 3 foi tratado com fluncia de 250 J/cm2 e freqncia de 100 Hz e o grupo 4 foi tratado com fluncia de 800 J/cm2 com radiao contnua. A avaliao histolgica e histomorfomtrica do dano muscular e da cicatrizao tecidual demonstrou melhor qualidade e quantidade do processo reparacional nos animais dos grupos irradiados. O grupo onde se obteve os melhores resultados foi aquele irradiado com 800 J/cm2 e com radiao contnua.

Em 1998, LOWE et al. estudaram a ao de um diodo laser operando em 890 nm sobre a cicatrizao de feridas padronizadas em dorso de rato. Os autores trabalharam com fluncias de 0,18, 0,54 e 1,45 J/cm2. As reas foram analisadas por sistema de imagem por meio de vdeo e os autores no observaram efeitos estimulativos nos animais irradiados em relao aos do grupo controle, sendo que no grupo irradiado com fluncia de 1,45 J/cm2 houve significativa inibio do processo cicatricial aos 16 dias da primeira irradiao.

Em 1999, ALMEIDA-LOPES et al. apresentaram um estudo clnico em ps-operatrio de 150 pacientes submetidos a cirurgia oral menor, repetindo o mesmo protocolo de um estudo in vitro que haviam publicado anteriormente (ALMEIDA-LOPES et al., 1998b). Os pacientes foram divididos em trs grupos: um controle no irradiado, um irradiado com um diodo laser operando em 635 nm e outro com um diodo laser operando em 780 nm. As irradiaes foram feitas no ps-operatrio imediato, aos 7 dias e 14 dias aps interveno cirrgica, quando necessrio. A fluncia utilizada foi de 2 J/cm2. Os grupos irradiados apresentaram cicatrizao significativamente mais rpida alm de qualidade esttica superior quando comparados ao grupo controle. No houve diferena significativa entre os grupos irradiados com diferentes comprimentos de onda.

2.3.2.3. Efeitos Vasculares

Microcirculao

Foi demonstrado que o laser de baixa potncia aumentava o grau de vascularizao do tecido neoformado, quando se irradiava feridas em processo de cicatrizao.

Em 1982, BENEDICENTI demonstrou que o fluxo de sangue em capilares mesentricos aumentou aps a irradiao com um diodo laser operando em 904 nm, fenmeno esse confirmado em 1984 por MIR et al. que utilizaram como modelo de estudo o leito de unha e irradiaram com um diodo laser de As-Ga, observando que a circulao da regio aumentou aps a irradiao. O incremento do fluxo sangneo continuou durante 20 minutos aps cessar a irradiao com laser, inclusive quando a rea alvo foi esfriada. Em 1983, TRELLES et al. publicaram um experimento realizado em olho de coelho onde novamente foi confirmado esse fenmeno. Resultados similares foram obtidos em 1984 por MAYAYO e TRELLES, quando irradiaram mucosa anal de ratos. Nesses experimentos o esfncter final dos capilares foi o primeiro a responder e a resposta dependeu da severidade da leso na microcirculao.

MIR concluiu que a vasodilatao e o aumento da microcirculao so resultados de um aumento do metabolismo tecidual e da normalizao da homeostase.

Fluxo Linftico

LIEVENS foi um autor que trabalhou bastante no tema de efeitos do laser de baixa potncia na atividade do sistema linftico. Publicou vrios trabalhos bastante elucidativos nessa rea (1986, 1988, 1990). Em 1991, o autor publicou um estudo grande com 50 animais, onde fez incises na regio abdominal de ratos e as irradiou com um laser de He-Ne e um diodo laser de As-Ga operando em 904 nm. Avaliou a adeso ps-cirrgica, o edema local e a regenerao de veias e de vasos linfticos da regio mesentrica. Observou que ao irradiar essa regio com laser, o fluxo linftico instalou-se rapidamente. A regenerao dos vasos linfticos nos animais tratados com laser foi mais rpida que nos do grupo controle no irradiado. No primeiro grupo estava completa aos 9 dias, enquanto que o grupo controle apresentou regenerao incompleta ainda aos 55 dias aps a cirurgia. O autor tambm observou uma neovascularizao formada significativamente mais rpida nos animais tratados, que se deu em menos da metade do tempo que nos animais do grupo controle. A adeso peritoneal foi escassa nos grupos tratados com laser, enquanto que foi comum nos grupos controle.

Em 1986, LABAJOS observou que aps a irradiao do intestino de ratos com um diodo laser de As-Ga emitindo no infravermelho prximo, com fluncia de 1J/cm2, o fluxo de gua e eletrlitos atravs da parede do intestino dos animais do grupo irradiado foi retardado simultaneamente com um incremento do potssio intracelular.

Imunidade

MESTER et al., em 1977 num estudo sobre cicatrizao de feridas e TRELLES em 1986, num estudo sobre ao do laser de He-Ne sobre herpes genital, especularam que esse tipo de laser poderia agir sobre a funo imunolgica, envolvendo principalmente os leuccitos que incrementariam a fagocitose.

As publicaes que analisam estudos com esse tipo de laser envolvendo vrus e bactrias ainda causam controvrsia e so pouco esclarecedoras. O laser de baixa potncia atua como tratamento efetivo na preveno dessas infeces in vivo como demonstrou TRELLES em 1986 em tratamento de pacientes com surto de herpes genital que foram irradiados com laser de He-Ne, ou desse tipo de tratamento associado com acyclovir em herpes labial e facial, como demonstrou VLEZ-GONZLEZ et al., em 1994 num estudo clnico feito em 60 pacientes, onde trataram um grupo com laser de He-Ne, outro com associao de laser de He-Ne e acyclovir e outro somente com acyclovir. Os autores obtiveram melhores resultados nos grupos tratados com a associao de laser de He-Ne e acyclovir. Tambm outros autores demonstraram a efetividade desse tratamento na preveno de nevralgias ps-herpticas, como IIJIMA, que em 1991 apresentou um estudo com 18 pacientes portadores desse tipo de alterao, e tratou-os com laser de He-Ne, obtendo resultados favorveis.

Entretanto quando observamos estudos in vitro, verificamos que o laser de baixa potncia pode estimular o crescimento ou virulncia de bactrias e vrus em cultivo ou cultura. GILIOLI et al., em 1985 estudaram os efeitos de um diodo laser de As-Ga em HSV1 e HSV2 in vitro e observaram que esses vrus foram estimulados pela ao desse laser. Em 1987, RUBENSTEIN publicou um trabalho com 57 pacientes portadores de leses ulcerativas vulvares induzidas por papiloma vrus (HPV). Ele fez sua remoo com laser cirrgico de CO2 e irradiou o leito cirrgico com um diodo laser emitindo na regio do infravermelho prximo, com potncia de sada de 25 mW, duas vezes por semana, com irradincia de 22 mW/cm2. Obteve resultados benficos significativos, ao redor de 45%, nos casos assim tratados.

Esse assunto ainda muito polmico, porm autores como Trelles, 1986; Tner e Hode, 1996; e VLEZ-GONZLEZ et al., 1994; entre outros, atribuem esse efeito antiviral do laser de baixa potncia, que se demonstra in vivo, presumidamente ao efeito estimulativo do sistema imunolgico local e sistmico.

Em 1985, RUFFOLO, publicou um trabalho onde utilizou o laser de baixa potncia em tratamento de leucoplasias para alvio de sintomas daqueles pacientes que os apresentavam. O autor obteve bons resultados comentando que essa condio de normalizao da rea afetada seria devido a estimulao da imunidade local desses pacientes.

MAYAYO e TRELLES, em 1986 publicaram um artigo sobre laser de baixa potncia e imunidade, onde trabalharam com ratos portadores de aplasia tmica e os induziram septicemia. Irradiaram os animais a cada dois dias, com fluncia entre 2 e 4 J/cm2. Os animais que receberam irradiao sobreviveram mais tempo que os do grupo controle que no receberam irradiao. No mesmo ano, COBO PLANA et al. (1986) apresentaram um estudo sobre o uso do laser de baixa potncia na profilaxia da osteorradionecrose manipular. Os autores mostraram que utilizando um diodo laser operando em 904 nm, com fluncia de 2 J/placa, diminuiu o crescimento de bactrias in vitro. Com um laser de He-Ne, com a mesma fluncia, no houve alteraes nessas placas. Em 1987, CARRILLO et al., fizeram um estudo in vitro sobre o crescimento de uma cepa de Stafilococus aureus, onde utilizaram um laser de He-Ne com fluncias de 0,3 J/cm2 e 0,6 J/cm2. Os autores no observaram nenhum crescimento significativo.

Em 1991, SKOBELKIN et al., apresentaram um estudo clnico de pacientes oncolgicos, que visava a ativao do seu sistema auto-imune como preparo pr-operatrio. Foi um estudo envolvendo 60 pacientes onde os autores propuseram que essa terapia poderia ser utilizada como coadjuvante em pacientes portadores de imunodeficincias. Os pacientes foram divididos em quatro grupos e irradiados no pr-operatrio imediato. Um grupo foi controle, outro irradiado transcutaneamente (sobre linfonodos) com um diodo laser operando em 890 nm, outro irradiado internamente com laser de He-Ne, e outro com uma associao de ambos mtodos de irradiao. Os estudos avaliaram componentes de clulas brancas do sangue, ensaios de atividade imunoglobulnica (IgA, IgM e IgG) alm de determinao do comportamento de fraes de linfcitos T. Essa avaliao foi feita antes e depois das irradiaes. Os autores observaram que a resposta imunolgica dos pacientes irradiados foi significativamente aumentada em relao aos do grupo controle.

Em 1995, FILONENKO estudou os efeitos do laser de baixa potncia na defesa imunolgica especfica e no especfica. Utilizaram esse tratamento como preveno de complicaes ps-cirrgicas em alteraes de joelho e em ps-operatrios de liffting facial cirrgico.

Em 1997b, WEI YU et al., estudaram a ao de um laser de Argon:Dye operando em 630 nm em ratos portadores de septicemia crnica. Os autores queriam verificar se o laser de baixa potncia tinha efeito estimulativo na resposta autoimune em septicemia, usando modelo animal. Os autores abriram a cavidade abdominal de ratos e os submeteram cirurgia. A irradiao foi feita no ps-operatrio imediato com fluncia de 5 J/cm2. Num experimento a parte, linfcitos de ratos normais in vitro foram utilizados para verificao dos efeitos bioestimulativos do laser. Os autores observaram in vivo que o laser de baixa potncia aumentou significativamente a proliferao de linfcitos nos ratos com septicemia bem como o tempo de sobrevivncia desses animais quando comparados aos do grupo controle no irradiado. Os autores verificaram in vitro que o laser de baixa potncia estimulou significativamente a proliferao de linfcitos na presena de estmulo mitognico e aumentou a sntese de ATP linfocitria. Concluram que a irradiao laser aumentou a resposta imunolgica e a sobrevivncia dos ratos com septicemia.

Pelos trabalhos at aqui revisados observamos que a ao do laser de baixa potncia na cicatrizao tecidual in vivo depende de mecanismos complexos envolvendo eventos celulares e humorais. Para analisar esses eventos individualmente, fizemos a reviso da ao do laser de baixa potncia in vitro, sobre as principais clulas envolvidas no processo de cicatrizao.

2.4. Reviso dos Efeitos do Laser na Cicatrizao in vitro

2.4.1. Cultura de Clulas

O estudo in vitro utilizando cultura de clulas tem sido muito usado devido facilidade de padronizao da amostra, cujo controle de pH, temperatura, presso osmtica, tenso de CO2 e de O2 podem ser obtido de maneira precisa, alm de conseguir-se amostras totalmente homogneas. As desvantagens desse mtodo de estudo so, por exemplo, a necessidade de trabalhar-se em ambiente estril e assptico, o que limita algumas vezes seus protocolos. Alm disso exige uma certa prtica por parte do pesquisador. Alm disso a quantidade de material obtido em cultura bastante pequeno; ainda assim o custo de um experimento feito com clula em cultura muito maior que o mesmo feito em animais (FRESHNEY, 1990).

MENEGAUX et al. (1934) apud KAWAHARA et al. (1968), relatam que o primeiro estudo in vitro sobre materiais implantados foi realizado em medicina na rea de ortopedia. Em odontologia foram realizados estudos in vitro utilizando cultura de clulas por KAWAHARA et al. (1955) e Grant (1955) apud KAWAHARA et al. (1968) para avaliar a citotoxidade de materiais dentrios.

Atravs da observao da morfologia celular, efeitos na membrana, atividade celular e ndice de proliferao, pode-se avaliar o dano celular. Em 1959, BERGMAN apud SPANGBERG (1969) introduziu o mtodo de contagem celular e de nmero de mitoses para avaliao do dano celular, onde mistura-se a suspenso celular e a soluo teste em uma cmara de cultura apropriada. Esta consiste de um anel de vidro fixada a uma lmina. Aps a fixao e colorao da cultura as clulas e mitoses so contadas.

Outros mtodos de avaliao do dano celular foram propostos. Em 1965, GUESS et al. apud SCHMALZ (1994) relataram que efeitos de membrana poderiam ser demonstrados pelo vermelho neutro, que armazenado em clulas viveis e liberado no meio circundante aps dano celular. Esse mtodo porm considerado subjetivo.

SPANGBERG, em 1973, para avaliao da citotoxidade do material, introduziu o mtodo da mensurao da liberao de um istopo radioativo incorporado no interior das clulas (cromo radioativo - 51Cr), baseado no dano celular aps contato direto material-clula. Para avaliao quantitativa do dano celular, usada a liberao de marcadores radioativos de clulas alvos. Aps a exposio a materiais txicos, ocorrer dano celular e a liberao de DNA marcado pode ser medida para indicar o dano celular. Esse mtodo tem sido amplamente utilizado como teste de avaliao para muitos materiais dentrios, cujas vantagens so ser um mtodo rpido, altamente sensvel, que possibilita adequado contato material-clula e permite quantificao objetiva do dano celular com boa preciso.

Em 1980, a Federao Dentria Internacional recomendou que a avaliao da toxidade de materiais dentrios fosse feita segundo nveis biolgicos, ou seja, testes iniciais, testes secundrios e, finalmente, testes de uso.

De acordo com SCHMALZ (1994), outros mtodos basearam-se na excluso do corante Azul de Trypan, o qual penetra nas clulas mortas, com leso da membrana celular, enquanto isso no ocorre nas clulas vivas, que apresentam membrana ntegra.

Em 1990, POLLARD sugeriu que a determinao do nmero celular fosse realizada usando-se um contador eletrnico de partculas ou atravs de um hemocitmetro. O primeiro mtodo mais preciso e pode ser usado para contar baixas concentraes celulares. O segundo requer maior densidade celular e mais propenso a erro de amostragem. Entretanto permite uma estimativa visual do estado das clulas e pode ser usado para estimar a viabilidade celular quando combinado com a excluso do corante azul de Trypan. Para a contagem, as clulas so ressuspendidas e diludas em azul de Trypan. Uma gota de suspenso celular adicionada aos dois lados do hemocitmetro; isso feito para determinar a viabilidade celular, j que o nmero de clulas que no se coram so aquelas que apresentam a membrana intacta.

No mesmo ano, Baserga relatou que clulas em cultura podiam crescer por aumento no tamanho da clula ou por aumento de seu nmero. A contagem de clulas em uma placa de Petri nos diz quanto a populao celular cresceu, porm no informa se as clulas esto ou no proliferando. Quando desejamos determinar o efeito de qualquer alterao da proliferao celular no meio de cultura, ou seja, sua capacidade de estimular ou inibir a diviso celular, o mtodo mais indicado contar o nmero de clulas antes e aps o tratamento, de preferncia a cada 24 horas. Para indicar se uma populao celular est crescendo ou no, o melhor parmetro contar o nmero de clulas por placa de cultura.

Em 1996, CIAPETTI et al. afirmaram que os mtodos que empregam a incorporao de nucleotdeos, ainda que sejam sensveis, apresentam desvantagens como uso de equipamentos e sala especficos, perigo de manuseio dos marcadores radioativos, bem como gerao de resduos radioativos.

A citotoxidade de materiais dentrios in vitro, segundo MJR et al. (1985) foi avaliada por meio de medidas de crescimento celular, alteraes na permeabilidade da membrana, alteraes metablicas ou alteraes citopticas. Alguns mtodos avaliam a citotoxidade por dois ou mais desses parmetros associados.

Em 1998, DANIEL esclareceu que trs testes utilizados para avaliar a citotoxidade so baseados em alteraes na permeabilidade da membrana (teste do revestimento com gar; teste da liberao de 51Cr) e em alteraes metablicas combinadas com um corante celular e microscpio (teste do filtro Millipore). O mtodo da liberao do 51Cr, alm de uma rea de trabalho estril e incubadora com controle de ar, umidade e temperatura, requer um espectmetro gama ou um contador de cintilao lquida e um sistema de distribuio de resduos radioativos. Se a substncia teste tem a capacidade de precipitar protenas, esse mtodo pode indicar um resultado falso, dando uma baixa liberao de 51Cr. No mtodo do revestimento com gar o material colocado em contato direto com o gar que reveste uma monocamada celular, a qual corada com vermelho neutro vital. Ao ocorrer lise celular, registra-se um "ndice de resposta" baseado no tamanho da difuso pela zona descolorida e a porcentagem das clulas lisadas dentro das zonas. O mtodo do filtro Millipore registra de acordo com um escore baseado na intensidade da colorao da zona e o dimetro ou extenso das reas afetadas, classificando o material como no txico, levemente txico, moderadamente txico e severamente txico.

Em 1990, FRESHNEY revendo os ensaios em cultura de clulas, colocou que podem ser divididos em duas classes: (1) Resposta imediata ou de curto prazo, tal como alterao na permeabilidade da membrana ou perturbao de uma via metablica; e (2) Sobrevivncia a longo prazo, geralmente medida pela reteno da capacidade de auto-renovao ou sobrevivncia em estado alterado, como por exemplo, transformao maligna. Os ensaios de curta durao so usados para medir a proporo de clulas viveis aps um determinado procedimento traumtico. Segundo Daniel (1998) a maioria dos testes de viabilidade baseiam-se no rompimento da integridade da membrana, determinado pela penetrao de um corante ao qual a clula normalmente impermevel (azul de Trypan, eritrosina, nigrosina), ou a liberao de um corante ou istopo normalmente retido pelas clulas viveis (diacetato de fluorescena ou cromo radioativo). Os ensaios a longo prazo so usados para demonstrar a capacidade metablica ou proliferativa das clulas aps influncia txica, cujo objetivo medir a sobrevivncia.

BROWNE & TIAS em 1979 revisam o tema da dependncia celular sobre o resultado da citotoxidade in vitro. Segundo eles, com relao ao tipo celular a ser utilizado no experimento, muitos aspectos destes testes so relevantes para a simulao do uso clnico de materiais dentrios como o tipo de clula usado, mtodo de contato dela com o material, estado fsico do material e o mtodo de avaliao da citotoxidade. Concluram porm que o tipo de linhagem celular experimental empregada no experimento no era um fator decisivo na determinao da toxicidade de um material.

SCHMALZ (1994) afirmou que podem ser usados dois tipos de clulas: (1) linhagens de clulas permanentes derivadas de colees tipo cultura (ou de fontes comerciais) e (2) linhagem de clulas primrias, derivadas de explants e estabelecidas em cada laboratrio individualmente. O autor afirma que a escolha do mtodo de registro deve ser baseada na informao que se deseja. Primeiramente o autor preconiza o uso de mtodos mais simples, baseados nos efeitos de membrana ou no ndice de proliferao celular. Caso haja necessidade de informaes mais detalhadas, devero ser usados mtodos mais sofisticados, baseados na atividade celular. Esse autor acredita que o uso do ndice de proliferao para registrar o dano celular um dos mtodos mais antigos e mais comumente utilizados. As vantagens da contagem celular direta que a mesma fcil de realizar e pode ser combinada com um corante vital a fim de excluir as clulas mortas.

Sabemos que o comportamento do fibroblasto humano de pele diferente daquele observado no fibroblasto humano de mucosa, ainda que mantidos nas mesmas condies. Apesar disso, a maioria dos trabalhos in vitro utilizam fibroblastos obtidos partir de amostras de pele humana, ou ainda de animais, pela praticidade de se trabalhar com fibroblastos de linhagens j estabelecidas, menos sensveis a variaes e que se podem adquirir no mercado.

Linhagens celulares obtidas de cultivos primrios so mais delicadas e exigem um certo tempo de trabalho e grande dedicao antes de poder-se comear o experimento propriamente dito. Por isso, poucos autores demonstram a atividade dos lasers de baixa potncia sobre fibroblastos de mucosa humana, sobretudo em linhagem primria.

2.4.2. Estudos in vitro

2.4.2.1. Angiognese

Em 1988, TRELLES et al. fizeram um estudo em lngua de ratos para observao de nveis de histamina local e sistmica, aps tratamento com laser emitindo na regio do visvel, operando em 632,8 nm, utilizando potncias pticas de sada de 4 mW e de 50 mW com fluncia de 2,4 J/cm2. Com a potncia ptica de sada de 4 mW observavam localmente nos grupos irradiados, aumento de 100% de histamina e nos grupos irradiados com potncia ptica de sada de 50 mW, um aumento de 30%. Os autores tambm observaram diferena significativa na liberao de histamina nvel sistmico em relao aos grupos controles.

Em 1989a, os mesmos autores (TRELLES et al.) repetiram o experimento com o mesmo modelo, mesmo comprimento de onda e mesma fluncia, variando apenas as potncias pticas de sada dos aparelhos, que foram de 4 mW e 15 mW, variando portanto a irradincia. A anlise de liberao de histamina local foi feita atravs de radioimunoanlise e foi feito estudo da morfologia da lngua por meio de microscpio eletrnico de transmisso. Nos grupos irradiados foi observada marcada vasodilatao e degranulao ativa de mastcitos quando comparados aos grupos controle. Os nveis de histamina foram mais altos nos grupos irradiados com o laser de potncia ptica de sada de15 mW.

Em 1990, EL SAYAD e DYSON utilizaram diodos lasers emitindo em diferentes comprimentos de onda (l = 660, 820, 870, 880, 940, 950 nm) sobre modelo animal. No grupo controle a irradiao foi feita com uma luz comum. Quando irradiaram pele normal com qualquer um dos comprimentos de onda do laser, houve maior nmero de mastcitos, embora sem degranulao, enquanto que os grupos irradiados com luz comum apresentaram resultados nulos. Quando irradiaram pele lesada, observaram aumento tanto no nmero como na degranulao de mastcitos em comparao com os grupos controle irradiados com luz comum. Os autores relataram que controlaram a temperatura durante a irradiao e que observaram uma elevao mxima na temperatura local dos animais de 1,8C, que se normalizou aos 4 minutos, e no atriburam os resultados obtidos no experimento esse fato.

2.4.2.2. Sistema Imunolgico
Linhas Hematolgicas

Em 1989, VISCOR et al. usaram um laser de He-Ne com irradincia de 0,5 mW/cm2 para estudar a curva de fragilidade osmtica de eritrcitos. Observaram que nos grupos irradiados com laser, houve alterao da viscoelasticidade da membrana eritrocitria sem evidncias de alterao em sua estrutura.

Em 1989, SHIROTO et al. estudaram os efeitos de dois diodos lasers de As-Ga-Al sobre a atividade de neutrfilos de amostras de sangue humano de adultos saudveis. Dividiram as amostras em 4 grupos. Os grupos 1 e 2 foram irradiados com um diodo laser operando em 830 nm, o grupo 3 com um diodo laser operando em 904 nm, e o grupo 4 foi utilizado como controle e no foi irradiado. Utilizaram fluncia e irradincia diferentes para todos os grupos. Os autores observaram que todos os grupos irradiados apresentaram maior atividade fagocitria dos neutrfilos, sendo que os resultados mostraram que essa atividade dependeu da fluncia, j que os melhores resultados foram obtidos no grupo irradiado com o diodo laser operando em 830 nm com potncia nominal de 60mW.

Em 1991, VINCENT et al. estudaram a ao de um laser de Argon:Dye sobre clulas sangneas, irradiando sangue de coelhos e humanos. Observaram que o comprimento de onda emitido em 630 nm foi fortemente absorvido pelo sangue. Com um hematcrito entre 42 e 50 e uma espessura de fluxo de sangue de 0,15 mm, absorveu 42% da luz e quando a espessura do fluxo foi de 1 mm, absorveu 80% da energia laser, com uma transmisso de 20%.

Em 1994, OKANE et al. utilizaram um diodo laser operando em 660 nm para estudar a incorporao de timidina tritiada em linhagem celular hematopoitica (pr-moncitos e linha mielide). Com fluncia maior ou igual a 5,8 J/cm2 produziu-se uma reduo significativa da incorporao de timidina tritiada na linha mielide. Com fluncia de 5,8, 7,2 e 11,5 J/cm2 , o mesmo ocorreu na linha pr-monoctica. Para nenhuma fluncia houve aumento da incorporao de timidina tritiada em nenhuma das linhas e a viabilidade celular foi de 95%. Os autores observaram que a causa poderia ser por mudanas na proporo de clulas nas diferentes fases do ciclo celular ou por induo da diferenciao celular.

Em 1996, CALLAGHAN et al. estudaram a ao de um diodo laser emitindo na regio do visvel operando em 660 nm sobre uma linhagem de clulas hematopoiticas U937. Usaram fluncias que variaram de 1,0 a 11,5 J/cm2. A sntese de DNA foi significativamente aumentada quando utilizadas fluncias de 2,9 e de 8,6 J/m2.

Linfcitos

Em 1987, OHTA et al. estudaram os efeitos de um diodo laser de As-Ga sobre linfcitos, com diferentes fluncias. Observaram que quando irradiaram linfcitos com fluncia de 10,8 mJ/cm2 produziu-se uma inibio da proliferao celular.

Em 1988, FEDOSEYEVA et al., da equipe de KARU, estudaram a ao do laser de He-Ne sobre linfcitos. Observaram que com uma fluncia de 56 J/cm2 obtiveram os mesmos resultados de quando utilizaram uma determinada substncia de ao mitgena (a fitohemaglutinina). Observaram a unio de DNA com acridina-orange.

Em 1989, Inoue et al. estudaram o efeito mitgeno de um diodo laser de As-Ga-Al sobre linfcitos. Com fluncias variando de 14,2 a 28,3 mJ/cm2 produziu-se inibio na replicao celular. Com fluncia de 849 mJ/ cm2 produziu-se um aumento da replicao celular.

Em 1990, CHIO et al. estudaram os efeitos de trs diferentes lasers (He-Ne, As-Ga-Al e Argnio) sobre linfcitos in vitro. Observaram que o ndice mittico foi inversamente proporcional a fluncia de irradiao e que as rupturas cromossmicas aumentaram proporcionalmente com a fluncia. Com o laser de He-Ne e com o diodo laser de As-Ga-Al no observaram nenhuma alterao significativa em relao ao grupo controle, tanto no ndice mittico como nas rupturas cromossmicas.

Em 1991, NARA et al. estudaram os efeitos do He-Ne sobre suspenso de linfcitos da circulao sangnea perifrica de humanos. Utilizaram fluncias que variaram de 5 a 20 J/cm2 sobre esses linfcitos in vitro, mantidos em meio pobre em nutrientes e os resultados foram comparados aos grupos tratados com um mitgeno de origem vegetal (Concanavalina A). Observaram que em meio pobre em nutrientes, a irradiao com laser provocou um aumento significativo no ndice mittico, efeito que no se produziu quando o meio de cultivo foi o adequado para os linfcitos. O nmero de clulas viveis no se alterou com a irradiao laser. Nessa poca os autores fizeram uma importante afirmao, considerando que o efeito bioestimulador do laser dependia do estado fisiolgico em que se encontravam as clulas antes da irradiao.

Durante o ano de 1991, KARU et al. (1991a, 1991b) publicaram uma srie de artigos onde estudaram a incorporao de timidina tritiada em suspenso de linfcitos em meio livre de mitgenos, em comparao a grupos controles de cultivos estimulados com fitoaglutininas. No houve diferena significativa entre os grupos. Aps a irradiao dos cultivos acrescentaram fitoaglutininas ao meio, e observaram aumento na sntese de DNA, em comparao com a presena do mitgeno isolado. Em outro artigo da srie, os autores comunicaram os resultados obtidos com o mesmo protocolo observando a expresso do receptor para Interleucina-2 em linfcitos irradiados, sem obterem resultados significativos (1991c).

KARU (1991d) concluiu que o laser de He-Ne, com fluncia de 56 J/cm2, produziu um aumento no fluxo de ons de clcio a curto prazo (alguns minutos) e um aumento da sntese de DNA a longo prazo.

Em 1992, HERBERT et al. estudaram a concentrao de AMP, ADP e ATP em linfcitos em suspenso aps sua irradiao com diodo laser operando em 820 nm com diferentes fluncias. Com fluncia de 1,2 J/cm2 produziu-se um aumento de ATP e diminuio de ADP, no se verificando alteraes na concentrao de AMP.

Em 1992, FUNK et al. estudaram a produo de citocinas aps irradiao com laser de He-Ne sobre cultivos de clulas mononucleares de sangue perifrico humano. Os autores irradiaram essas clulas em diferentes intervalos de tempo e utilizando diferentes fluncias. Os autores verificaram que a mdia de incorporao de timidina tritiada ao DNA das clulas irradiadas decresceu de acordo com o aumento da fluncia. Os nveis de interleucina-1a (IL-1a ), interleucina-2 (IL-2), fator de necrose tumoral-a (TNF-a ) e interfern-g (IFN-g ) foram quantificados no sobrenadante, antes e depois da irradiao. Observaram que as linfocinas aumentaram aos 30 minutos depois da irradiao, diminuindo porm aos 60 minutos. A incorporao de timidina tritiada diminuiu medida que se aumentou a fluncia.

Em 1995, VOLPI et al. usaram um laser de He-Ne para estudar a ao do laser de baixa potncia sobre granulcitos e linfcitos. Observaram que aos 30 minutos aps a irradiao, produziu-se nos linfcitos um aumento estatisticamente significativo de ATP e aos 60 minutos produziu-se nos granulcitos, sem modificao no total de adenilato da clula.

Em 1997, MANTEIFEL et al. estudaram as alteraes ultraestruturais em mitocndrias de linfcitos humanos aps irradiao com laser de He-Ne. Aps a irradiao dessas clulas com fluncia de 56 J/cm2, foram feitos cortes ultra-finos para anlise em microscopia eletrnica. Os autores observaram que nas clulas irradiadas houve um aumento de 20% no nmero de perfis mitocondriais na seco celular sem aumento em sua rea total e que o nmero de mitocndrias foi reduzido.

Macrfagos e Granulcitos

Em 1985, HUBACEK et al. estudaram os efeitos do laser de He-Ne sobre a atividade fagocitria de neutrfilos cultivados com cristais de cdmio. Trabalharam com fluncias variveis de 0,3, 0,7 e 1,5 J. Quando trabalharam com a primeira, no observaram efeito significativo sobre a fagocitose. A segunda estimulou a atividade fagocitria e a terceira produziu inibio desse fenmeno.

Em 1989, KARU et al. estudaram os efeitos do laser de He-Ne sobre a atividade fagocitria de neutrfilos, verificando que houve um incremento dessa atividade nos grupos irradiados em relao aos controle no irradiados.

Em 1989, RICEVUTI et al. estudaram a ao do laser de He-Ne sobre granulcitos em diferentes meios de cultivo. Avaliaram sua migrao in vitro, seu metabolismo oxidativo, sua agregao granuloctica e a liberao de ATP dessas clulas. Em todos os cultivos produziu-se marcada inibio na migrao celular comparado com os grupos controles, quando irradiados com fluncia de 2 J. Quando irradiaram esses cultivos com fluncia de 4 J, essa inibio foi mxima. Para nenhuma das fluncias utilizadas houve modificao no metabolismo oxidativo. Os autores observaram a diminuio da liberao de ATP porm, aps um estmulo mitgeno, houve um aumento na produo de ATP, somente nos grupos irradiados com fluncia de 4 J. Esses mesmos autores trabalharam em humanos, irradiando pacientes a cada 12 horas com fluncia de 2 J. Observaram uma diminuio significativa da celularidade global no sangue perifrico. Estudaram tambm a presena de uma glicoprotena de membrana envolvida na quimiotaxia e agregao (CD 11a, b, c e CD 18). Observaram que seus nveis sricos no se modificaram aps a irradiao.

Em 1990, OSANAI et al. estudaram a ao fagocitria de neutrfilos utilizando um diodo laser de As-Ga-Al. No observaram nenhuma alterao significativa nos grupos irradiados em relao aos controle no-irradiados.

Em 1990, YOUNG et al. estudaram a ao de um diodo laser de As-Ga-Al emitindo em diferentes comprimentos de onda (l = 660, 820 e 870 nm) sobre granulcitos. Observaram que a mxima ativao da bomba de sdio e potssio aconteceu quando se utilizou fluncias que variaram de 4 a 8 J/cm2. Quando utilizaram fluncias maiores que isso, aconteceu inibio desse mecanismo. Trabalharam ainda com diferentes freqncias de onda e observaram que a freqncia mais ativa para a bomba de clcio foi a de 16 Hz, ainda que com freqncias de 4,56, 700 e 5000 Hz, tambm observaram aumento de sua atividade. No houve diferena significativa nos resultados encontrados para os diferentes comprimentos de onda utilizados.

Em 1991, OSTUNI et al. utilizaram um laser de He-Ne para estudar as alteraes na fluorescncia intrnseca emitida por granulcitos, moncitos e linfcitos na vascularizao perifrica, antes e depois da irradiao. No houve alteraes significativas em linfcitos e em moncitos, porm houve em granulcitos quando irradiados com um diodo laser operando em 280 nm.

Em 1991 e 1992, BOLTON et al. estudaram a ao de um diodo laser operando em 820 nm sobre cultivo de macrfagos. Irradiaram os cultivos, aspiraram seu meio e o colocaram em cultivo de fibroblastos, estudando a replicao destas clulas. Quando utilizaram irradincia de 400 mW/cm2 e fluncias variando de 2,4 a 7,2 J/cm2, verificaram aumento significativo na populao de fibroblastos. Seguindo o mesmo protocolo, estudaram se a luz polarizada podia afetar a proliferao dessas culturas. Compararam lasers com polarizao de 95% e de 14%. Observaram que a primeira polarizao foi mais eficiente que a segunda.

Em 1994, RAJARATNAM, utilizou o mesmo protocolo dos trabalhos publicados anteriormente trabalhando com diferentes freqncias de emisso (2,28; 18,24; 292,3 e 1000 Hz) com fluncia fixada em 7,2 J/cm2. Todas as freqncias produziram aumento significativo no nmero de fibroblastos em comparao aos grupos irradiados com luz comum.

2.4.2.3. Queratincitos e Clulas Epiteliais

Em 1988, SCHNEEDE et al. utilizaram um laser de He-Ne linhagem de clulas epiteliais controlando a incorporao de timidina tritiada, o consumo de glicose e a produo de lactato, assim como a sntese de prostaglandina E2. Com fluncias de 142 e 569 J/cm2 no houve alterao no nmero de mitoses. Uma hora depois da irradiao, a incorporao de timidina tritiada diminuiu transitoriamente durante seis e nove horas. O autor tambm observou diminuio no consumo de glicose e um ligeiro aumento de LDH. A sntese de PgE2 diminuiu significativamente depois da irradiao.

Em 1990, Mester e SNOW estudaram o efeito do laser de He-Ne sobre a maturao e regenerao de explants neuroepiteliais olfatrios embrionrios. Para uma fluncia de 0,5 J/cm2, observaram diferena significativa em relao aos grupos controles.

Em 1990, GROSS e JELKMANN utilizaram o laser de He-Ne para irradiar clulas epiteliais de rim em cultivo. Com fluncia de 4,7; 11,9 e 35,4 J/cm2 no houve alteraes significativas. Quando utilizaram fluncia de 71,1 J/cm2 observaram aumento no ndice mittico e para fluncia de 142,2 J/cm2 observaram inibio do fenmeno. Os pesquisadores controlaram a temperatura nos cultivos observando um aumento de menos de 0,065C, que no consideraram significativo.

Em 1990, HAAS et al. controlaram atravs de cmara de vdeo, durante seis horas, a migrao de queratincitos ao longo de uma franja de 0,1 mm, no centro de placas de cultivos confluentes de queratincito humano. A distncia em m m nos cultivos irradiados foi de 12 m m/hora, em comparao com os controles que foi de 4 m m/hora. O estudo da incorporao de bromodeoxiuridina sobre o mesmo modelo no foi conclusivo.

Em 1993, STEINLECHNER e DYSON, concluram que tanto o laser de He-Ne como o diodo laser operando em 904 nm estimularam a proliferao de queratincitos e que esta proliferao reduziu-se quando o cultivo estava confluente. Observaram ainda que o efeito foi muito importante quando as clulas cresceram em meio de cultivo pobre em soro (1%) e que o efeito bioestimulativo do laser produziu-se com fluncia muito baixa (0,25 J/cm2).

Em 1996, HSIN-SU et al. estudaram a ao do laser de He-Ne em queratincitos humanos em cultivo para avaliar os nveis de Interleucina-1a (IL-1a ) e Interleucina-8 (IL-8). Utilizaram fluncia de 1,5 J/cm2. Os resultados revelaram que houve aumento significativo na produo de IL-1a e IL-8 e suas respectivas expresses no RNAm nos grupos irradiados com laser em relao aos controle. Os autores observaram ainda que esse efeito estimulativo dependeu da concentrao de clulas em cultura.

Em 1998, GROSSMAN et al. estudaram os efeitos de diferentes fluncias sobre queratincitos em cultivo, buscando os parmetros mais adequados de irradiao para que um diodo laser operando em 780 nm produzisse efeito proliferativo sobre essas clulas. Obtiveram os melhores resultados nos grupos irradiados com fluncias entre 0,45 a 0,95 J/cm2. As demais fluncias utilizadas foram consideradas menos efetivas.

2.4.2.4. Enzimas

Durante o ano de 1991, vrias equipes publicaram estudos sobre os efeitos do laser de baixa potncia na modulao, ativao e sntese enzimtica. Nesse ano HUG e HUNTER escreveram um artigo sobre foto-modulao enzimtica e dedicaram uma parte somente bioestimulao laser. Eles utilizaram os trabalhos de KARU e de sua equipe sobre bactrias, leveduras e cultivos celulares, e concluram que com alta fluncia, quando se usava diodos lasers emitindo na regio do visvel e na regio do infravermelho prximo, produzia-se atraso no crescimento dos microorganismos e inibio de suas cadeias respiratrias. Tambm concluram que a ao bioestimuladora do laser de baixa potncia dependia do estado fisiolgico em que a clula se encontrava no momento da irradiao.

BOLOGNANI et al.(1991a e 1991b) trabalharam em sistemas enzimticos. Inativaram LDH incrementando o CO2 do meio. Aps irradi-las com laser de He-Ne com fluncia de 7,42 J/cm2, estas enzimas foram reativadas parcialmente (cerca de 60% delas) sem chegar a recuperao total (aos 100%). Observaram que a irradiao laser foi ineficaz na estimulao ou inibio da atividade de enzimas ativas, porm se as enzimas como Na-ATPase, K-ATPase eram inativadas parcialmente (3M-uria e/ou choque trmico), eram reativados novamente pela ao de um diodo laser de As-Ga com radiao pulsada, utilizando freqncia de 4,5 KHz. A inativao de miosina-ATPase por um aumento na perfuso de CO2, foi recuperada a 20% pela ao de um laser de He-Ne. Em 1993, o mesmo autor e sua equipe (BOLOGNANI) seguindo a mesma linha de pesquisa, estudaram a atividade da ATPase e ATPsintetase na miosina exposta irradiao laser e ao tratamento com campos eletromagnticos emitindo radiaes pulsadas. Os autores verificaram que a recuperao parcial da atividade da miosina ATPase inativada podia ser obtida por sua exposio ao laser. Os autores concluram que a atividade enzimtica foi aumentada pela sua exposio radiao laser ou aos campos eletromagnticos emitindo radiaes pulsadas.

Em 1994, OSTUNI et al. estudaram a atividade da enzima desidrogenase glutamato. Os autores usaram um laser de He-Ne com diferentes fluncias e irradincias. Para uma fluncia de 4 J/cm2 e uma irradincia de 1,7 mW/cm2, houve aumento da atividade enzimtica; com 10 mW/cm2 houve diminuio na atividade enzimtica e com 24 J/cm2 para ambas irradincias utilizadas (7 e 10 mW/cm2) houve aumento na atividade enzimtica.

Em 1995, BOLTON et al. publicaram um estudo dos efeitos de um diodo laser operando em 860 nm, utilizando fluncias de 2 e 16 J/cm2, na proliferao celular de fibroblastos humanos de pele em linhagem primria e na atividade da succinato desidrogenase (enzima diretamente unida cadeia de transporte eletrnico). Os autores observaram que com fluncia de 2 J/cm2, os nveis dessa enzima aumentaram com a proliferao celular, efeitos esses que foram inibidos quando as clulas foram irradiadas com fluncia de 16 J/cm2.

2.4.2.5. Fibroblastos

Em 1982, RYHANEN et al. estudaram a atividade das enzimas colagenase e gelatinase, que intervm na degradao do colgeno. Os autores cultivaram fibroblastos em meio de cultivo isento de soro. Irradiaram essas culturas com dois diferentes tipos de lasers: He-Ne e um diodo laser de As-Ga, e observaram o comportamento dessas enzimas. No houve alterao em sua atividade, nem na atividade da elastase. Concluram que o aumento na formao de colgeno descrita neste estudo no foi devido diminuio em sua degradao e sim a um aumento de sua sntese. O estudo de viabilidade celular com a incubao de fibroblastos com azul de Trypan, no demonstrou alteraes. A atividade da LDH, e das enzimas intercelulares (que se liberam do citoplasma quando h alterao da integridade da membrana celular), no apresentou alteraes aps a irradiao.

Em 1883, Castro et al. (1983a, 1983b) estudarem a sntese de DNA aps irradiao com laser de Nd:YAG usando fluncia de 1,7 x 103 J/cm2 e incorporando timidina tritiada nos cultivos aps irradiao. Mostraram uma significativa reduo dessa sntese sem comprometimento da viabilidade celular. A incorporao de hidroxiprolina tritiada, quando se utilizou mesma fluncia, mostrou-se significativamente reduzida. Por meio de uma fonte de calor de uma luz halgena de tungstnio, com um aumento de temperatura entre 30 e 50C no se observou nenhuma diminuio na produo de colgeno. Portanto, os resultados indicaram que os efeitos observados com o laser de Nd:YAG no se podiam explicar unicamente devido sua ao trmica. Baseados nesses resultados ABERGEL et al., em 1984, relataram que os lasers de alta potncia como o Nd:YAG, podiam inibir de forma seletiva a produo de colgeno em situaes experimentais, tanto in vivo quanto in vitro. Em 1986, ABERGEL et al. monitoraram a sntese de colgeno com a incorporao de hidroxiprolina tritiada em cultivo de fibroblastos de pele humana. A proporo de hidroxiprolina a prolina no colgeno do tipo I purificado, sintetizado nesses cultivos, foi de aproximadamente 0,7. Os resultados indicaram que mais de 20% da 3H-radioativa incorporada estava no procolgeno recm sintetizado. Os autores observaram aumento de 3,3 vezes na produo de procolgeno em uma das linhagens de fibroblastos com hidroxilao de prolina de 3,5%, enquanto que um aumento de at 36 vezes na produo foi detectado dentro de outra linhagem, com um grau inicial de hidroxilao de prolina de 0,4%. O aumento mximo na produo de procolgeno foi obtido com os lasers de He-Ne e o diodo laser de As-Ga utilizando fluncias de 0,16 e 0,57 J/cm2. A hidroxilase de prolina uma enzima intracelular chave que catalisa a formao de hidroxiprolina a partir dos polipeptdeos de procolgeno recm sintetizado. No foi observada alterao na atividade desta enzima quando utilizadas fluncias de at 1,6 J/cm2 para o laser de He-Ne e de 1,94 J/cm2 para o diodo laser de As-Ga. Os autores tambm estudaram a replicao de DNA pela incorporao de timidina tritiada. Nos grupos irradiados com o laser de He-Ne no foi observada nenhuma alterao, entretanto nos grupos irradiados com o diodo laser de As-Ga, os autores observaram que essa replicao foi significativamente inibida. Tambm foi comprovada a estimulao com o laser de He-Ne na incorporao de leucina tritiada no colgeno. Foi feita a monitorao da temperatura das culturas durante a irradiao e no foi observada nenhuma alterao significativa nas culturas celulares.

Em 1985, GIMENEZ e CASADO fizeram um estudo sobre respirao tissular e observaram que a irradiao sobre clulas in vitro teve um efeito bioestimulador, resultando num aumento do consumo celular de oxignio e glicose. Quando a fluncia excedeu 1 J/mg de tecido, a resposta foi inibitria, com diminuio da respirao celular.

Em 1986, LAM et al., da equipe de ABERGEL, continuaram a linha de trabalho utilizando prolina, leucina e timidina tritiada, para estudo da ativao de proteases. Os autores fizeram a monitorao de temperatura, o estudo ultraestrutural e de viabilidade celular, em diferentes linhagens de fibroblastos. Concluram que o laser de He-Ne provocou um aumento do procolgeno porm no em todas as linhagens, assim como ausncia de alteraes nvel de DNA. Nos grupos irradiados com o diodo laser de As-Ga observaram diminuio na sntese de DNA. Nos demais parmetros no houve alteraes significativas. A partir desses trabalhos, vrios pesquisadores seguiram essa mesma metodologia.

Em 1988, LABBE et al. realizaram um estudo verificando nmero de clulas, sua viabilidade, morfologia, ndice mittico e totalidade de DNA, aps a irradiao com um diodo laser, sem observarem alteraes significativas. Demonstraram que houve um aumento nos nveis de absoro de hidroxiprolina e nos nveis de cido ascrbico e que ao subcultivar essas clulas irradiadas, os nveis anteriormente alterados se normalizaram. Propuseram assim, que o laser teria um efeito transitrio.

Em 1988, GLASSBERG et al. utilizaram eritrcitos, clulas endoteliais e fibroblastos para estudar a viabilidade celular e incorporao de timidina e leucina tritiada aps a irradiao com um diodo laser operando em 577 nm. Nos cultivos de clulas endoteliais ambas incorporaes foram inibidas quando utilizaram fluncias variando de 5 a 12 J/cm2. Nos cultivos de fibroblastos, foi preciso fluncias acima de 12 J/cm2 para a inibio da sntese de protenas. As fluncias de 5 a 8,5 J/cm2 no afetaram a viabilidade celular. Ao colocar eritrcitos em cultivo no se observaram alteraes significativas nas clulas endoteliais. Concluram que esse comprimento de onda foi mais absorvido pelos eritrcitos presentes em cultivo.

Em 1988, HALLMAN et al. fizeram um estudo com laser de He-Ne para verificar a proliferao celular de fibroblastos humanos em cultivo. Irradiaram essas clulas em diferentes passagens: entre a terceira e quarta e entre a dcima terceira e dcima quarta. No observaram nenhum efeito significativo estimulativo ou inibitrio do laser.

Em 1989, COLVER et al. obtiveram resultados negativos ao estudar os efeitos proliferativos, sntese de colgeno, migrao e sntese de glicosaminoglicans em fibroblastos, clulas epiteliais e endoteliais, utilizando um laser de He-Ne.

Em 1989, POURREAU-SCHNEIDER et al. estudaram a proliferao celular de fibroblastos de gengiva humana irradiados com um laser de He-Ne. Aps uma ou duas irradiaes, no observaram um aumento significativo no nmero de clulas, porm a partir da terceira irradiao houve um aumento estatisticamente significativo. Observaram ultra-estruturalmente: hipertrofia e hiperplasia mitocondrial com microfilamentos prximos membrana plasmtica e abundncia de matriz fibrilar nas regies pericelulares. Em 1990, a mesma equipe (POURREAU-SCHNEIDER et al.) fizeram um estudo in vitro com fibroblastos de linhagem primria e um estudo in vivo, irradiando feridas ps-cirgicas de dentes com indicao de exodontia. Os autores demonstraram que o laser de He-Ne ativou a transformao de fibroblastos de gengiva humana em miofibroblastos. Concluram que a induo de um fentipo com propriedades contrteis deveria influenciar clinicamente na acelerao do processo de cicatrizao.

Em 1990, WIEGAND-STEUBING et al. estudaram a incorporao de timidina tritiada em linhagem de clulas HeLa irradiadas com diodos lasers operando em trs diferentes comprimentos de onda: 405, 633 e 675 nm. Tambm estudaram a produo de TNF em linha de moncitos. No observaram alteraes significativas nos grupos irradiados em relao aos grupos controle no irradiados. Embora outros autores como KARU et al., em 1996, tenham utilizado essas mesmas clulas para verificao de parmetros ideais de irradiao, obtendo bons resultados. Os autores utilizaram luzes monocromticas operando entre 580 e 860 nm e um laser de He-Ne, com fluncia de 100 J/cm2. Observaram que a adeso clula-clula e clula-frasco foi estimulada pelo laser de He-Ne, fato que no ocorreu com os grupos irradiados com as luzes monocromticas.

Em 1990, Labbe et al. estudaram a incorporao de hidroxiprolina tritiada em linhagem de fibroblastos irradiados com um diodo laser de As-Ga-Al, tendo obtido aumento na absoro de hidroxiprolina tritiada nas culturas irradiadas.

Em 1992, VAN BREUGEL e BR estudaram a ao do laser de He-Ne sobre fibroblastos humanos em cultura. Os resultados mostraram que com irradincia abaixo de 2,9 mW/cm2 houve aumento na replicao celular enquanto que com 5,9 mW/cm2 no se produziram efeitos. Os autores afirmaram que quando se busca um efeito foto-biomodulador, a irradincia e o tempo de exposio a que submetemos essas clulas mais importante que a fluncia total. Tambm observaram que a produo de colgeno do tipo I foi proporcional proliferao celular.

Em 1992, NOBLE et al. estudaram a migrao de fibroblastos embrionrios em uma matriz de colgeno polimerizado. Observaram que os fibroblastos realizaram mais paradas e de maior durao, nas matrizes irradiadas e portanto, sua velocidade de deslocamento foi menor. As matrizes irradiadas apresentaram maior retrao. Os autores concluram que a turgidez do gel de colgeno poderia produzir um aumento do espalhamento (scattering) do laser com conseqente diminuio de sua transmisso e absoro, devido a fenmenos como a vibrao do gel que poderia haver detido o avano dos fibroblastos.

Em 1992, HEIN et al. estudaram os efeitos do laser de He-Ne e de Kriptnio (l = 647 nm) na sntese de colgeno e na atividade quimiottica de fibroblastos. Utilizaram fluncias de 0,05 a 32 J/cm2. Os autores no observaram resultados significativos entre os grupos irradiados com os dois tipos de laser em relao aos grupos controle no irradiados.

Em 1992a, LUBART et al. estudaram os efeitos de diodos lasers operando em diferentes comprimentos de onda: l = 360, 632, 780 nm em linhagens de fibroblastos. Avaliaram o ndice mittico e a morfologia dessa clulas por meio de microscopia eletrnica de varredura. Observaram que o nmero de mitoses nos cultivos irradiados aumentou significativamente em relao aos controles quando foi utilizada fluncia de at 15 J/cm2. Quando utilizada fluncia de 60 J/cm2, o nmero de mitoses diminuiu. Em 1993, os mesmos autores (LUBART et al.) estudaram o efeito proliferativo do laser de baixa potncia sobre cultura de fibroblastos. Os comprimentos de onda emitidos em 540 nm e entre 600 e 900nm produziram aumento significativo do nmero de mitoses. Os autores concluram que esses efeitos dependeram do comprimento de onda bem como da fluncia utilizada.

Em 1992, NARA et al. estudaram os efeitos de lasers emitindo em diferentes comprimentos de onda em fibroblastos de polpa dental humana. Trabalharam com um laser de He-Ne e dois diodos lasers emitindo na regio do infravermelho prximo (l = 790 nm e l = 830 nm). As fluncias variaram de 0,05 a 2 J/cm2. Os autores verificaram que os grupos irradiados com laser de He-Ne com baixa fluncia (0,1 J/cm2) mostraram proliferao no significativa em relao aos controle no irradiados, e os grupos irradiados com os diodos lasers no apresentaram qualquer efeito estimulativo.

Em 1994, WEI YU et al. estudaram o efeito de um diodo laser operando em 660 nm na produo de bFGF em cultura de fibroblastos 3T3 (linhagem preestabelecida). Os autores trabalharam com duas diferentes fluncias: 3,2 J/cm2 e 2,1 J/cm2. Verificaram que fibroblastos irradiados com menores fluncias demonstraram aumento na proliferao celular e na produo de bFGF, enquanto que aqueles submetidos a fluncias maiores, no demonstraram aumento na proliferao celular nem nos nveis de bFGF quando comparados aos do grupo controle no irradiados.

Em 1994, LOEVSCHALL e ARENHOLT-BINDSLEV, estudaram os efeitos de um diodo laser de comprimento de onda de 812 nm sobre fibroblastos de gengiva humana. Utilizaram no protocolo irradincia fixada em 4,5 0,5 mW/cm2 para todos os grupos variando as fluncias de 4,5 a 4500 mJ/cm2. Os autores controlaram a incorporao de timidina tritiada aps incubao de 16 horas. A incorporao demonstrou-se aumentada em todos os grupos irradiados, sendo a incorporao mxima observada nos grupos irradiados com fluncia de 450 mJ/cm2. Os autores concluram que o laser aumentou a sntese de DNA das clulas irradiadas.

Em 1995, LUBART et al. foto-sensibilizaram fibroblastos e queratincitos com derivados hematoporfirnicos e posteriormente os irradiaram com diferentes diodos lasers (l = 540, 633, 660, 780, 940 nm). Observaram que com ou sem hematoporfirinas, os grupos irradiados demonstraram aumento significativo na proliferao celular. Nos grupos irradiados com comprimentos de onda emitidos na regio do visvel, com a presena de corante, o efeito foi muito maior em relao aos grupos irradiados com comprimentos de onda emitidos na regio do infravermelho prximo. Os autores ainda observaram que os resultados obtidos com o laser de He-Ne (633 nm) foram dependentes da presena do pigmento exgeno, enquanto que no foram para o diodo laser de l = 940 nm.

Em 1996, RIGAU estudou o efeito de um laser de Argon:Dye operando em 633 nm no comportamento e na morfologia de fibroblastos de linhagem primria em cultivo. Trabalhou com um aparelho de potncia de sada de 38mW, com fluncia de 2 J/cm2 e irradincia de 4 mW/cm2. A autora verificou que esse tipo de laser induziu vrios efeitos biolgicos nos fibroblastos dos grupos irradiados como: formao de colnias, movimento de quimiotaxia e quimiocintica.

Em 1996, SKINNER et al. estudaram a ao de um diodo laser de As-Ga sobre fibroblastos de embrio humano em cultivo. As fluncias entre 0 e 1 J/cm2 durante perodos entre 1 e 4 dias. A produo de procolgeno foi monitorada pela incorporao de hidroxiprolina tritiada e a replicao de DNA, por incorporao de timidina tritiada. Os autores verificaram que o mximo de aumento na produo de colgeno e na bioestimulao celular ocorreu aps 4 aplicaes com intervalos de 24 horas entre elas. Fluncias de 0,09 a 0,52 J/cm2 tiveram efeitos estimulativos mais significativos na funo fibroblstica. Os autores concluram que os efeitos clnicos do laser de As-Ga podem ser resultado do aumento do tecido conectivo de reparao.

Em 1997, POGREL et al. estudaram o efeito do diodo laser de As-Ga-Al em fibroblastos e queratincitos em cultura. As culturas foram irradiadas com fluncias variadas e irradincias entre 5-100 mW. Os autores avaliaram a proliferao celular por absoro espectofotomtrica, a adeso celular por microcolorimetria, e observaram a migrao celular. No houve diferenas significativas entre os grupos irradiados e controle para ambos tipos de clulas cultivadas.

Em 1997, LUBART et al. estudaram os efeitos do laser de He-Ne nas concentraes de Ca2+ em fibroblastos. Irradiaram culturas com diferentes fluncias (1, 3 e 5 J/cm2) e observaram que com fluncias apropriadas para aumentar a proliferao celular, houve produo transitria aumentada na concentrao intracelular de clcio nas clulas alvos. Os autores concluram que essas observaes poderiam inclusive explicar a foto-bioestimulao em importantes processos biolgicos como a proliferao celular e a exocitose. Essa mesma autora, trabalhando com diferentes equipes, j havia anotado essa observao em um estudo que havia feito em 1992b (LUBART) com clulas de esperma de boi. Os autores irradiaram essas clulas com um laser de He-Ne e com um diodo laser operando em 780 nm, utilizando diferentes fluncias, e observaram que o transporte de Ca2+ nas clulas irradiadas foi acelerado, o que significou que a radiao laser estimulou mudanas de Ca2+ atravs da membrana celular. Os autores concluram que esse fato podia explicar as alteraes transitrias na motilidade dessas clulas, e em outras, o fato de disparar a mitose. No grupo da mesma autora, (LUBART et al., 1996) autores avaliaram o papel da oscilao intracelular de clcio na foto-bioestimulao, irradiando fibroblastos e queratincitos com diodos lasers operando em diferentes comprimentos de onda, sendo alguns emitidos na regio do vermelho (540 nm e 630 nm) e outros na regio do infravermelho prximo (780 nm e 940 nm). Observaram que quando utilizaram baixa fluncia houve um aumento significativo da proliferao celular em todos os grupos irradiados, porm apenas os grupos irradiados com laser de He-Ne e com diodo laser de l = 780 nm, tiveram alterao significativa na concentrao de Ca2+ nos fibroblastos irradiados.

Em 1998, WEBB et al. estudaram os efeitos de um diodo laser operando em 660 nm sobre duas linhagens primrias de fibroblastos humanos, uma originada de tecido normal e outra de cicatriz hipertrfica. Utilizaram fluncias de 2,4 e 4 J/cm2. Ambos os grupos tiveram um aumento significativo na proliferao celular em relao aos controles no irradiados.

Em 1998b, ALMEIDA-LOPES et al. fizeram um estudo piloto em fibroblastos de gengiva humana onde utilizaram dois diferentes diodos lasers operando em 635 nm e 780 nm. Irradiaram os fibroblastos previamente divididos em grupos com diferentes concentraes de soro fetal bovino. Os autores observaram que houve proliferao significativa para os fibroblastos cultivados em meio com dficit nutricional e irradiados quando comparados com os grupos controle cultivados com o mesmo meio e no irradiados. No houve diferena significativa para os grupos irradiados e controle que foram cultivados em condio nutricional ideal. No houve diferena significativa nos resultados obtidos para os diferentes comprimentos de onda.



 

3. Proposio
 

Na literatura compulsada parece haver controvrsia com relao aos efeitos do laser sobre o metabolismo celular de fibroblastos, clulas essas diretamente implicadas na reparao tecidual. H grande variao de parmetros, tais como comprimento de onda, fluncia, irradincia, tempo de aplicao, quantidade e freqncia dessas aplicaes.

Na literatura encontramos vrios trabalhos que demonstram que, em condies de normalidade tecidual, no se observa nenhum efeito aps a irradiao de laser nesses tecidos.

Sabemos tambm que o comportamento do fibroblasto humano de pele diferente daquele observado no fibroblasto humano de mucosa, ainda que mantidos em mesmas condies. Apesar disso, a maioria dos trabalhos in vitro utilizaram fibroblastos obtidos partir de amostras de pele humana, ou ainda de animais, pela praticidade de se trabalhar com fibroblastos de linhagens j estabelecidas, menos sensveis a variaes e que se podem adquirir no mercado. Linhagens celulares obtidas de cultivos primrios so mais delicadas e exigem um certo tempo de trabalho e grande dedicao antes de poder-se comear o experimento propriamente dito. Por isso, poucos autores demonstraram a atividade de lasers de baixa potncia sobre fibroblastos de mucosa humana.

O nosso objetivo :

1) Obter uma linhagem celular a partir de cultivo primrio de fibroblastos de gengiva humana.

2) Propor um modelo que simule uma condio in vitro de normalidade e outra de estresse celular.

3) Analisar o efeito dos lasers de baixa potncia na proliferao de fibroblastos originados dessa linhagem celular e em complementao, fazer uma anlise comparativa dessa proliferao em funo de diodos lasers operando em diferentes comprimentos de onda situados distantes uns dos outros dentro do espectro de radiaes eletromagnticas (operando na regio do visvel e outros na regio do infravermelho prximo).


4. Material e Mtodos

  1. Cultivo Celular
4.1.1. Obteno da Amostra

O material para o cultivo celular foi obtido de gengiva humana. Foi selecionada uma paciente de 24 anos, do sexo feminino, cuja anamnese revelou estado sistmico normal. A paciente no relatou uso de qualquer tipo de medicamento nem nenhum tipo de enfermidade sistmica. A paciente tinha indicao de extrao do segundo pr-molar inferior direito, hgido, para tratamento ortodntico interceptativo. Aps a extrao desse elemento dental, a paciente foi submetida gengivoplastia com remoo de tecido gengival na altura cervical lingual. A cirurgia deu-se sob anestesia troncular do nervo alveolar inferior, em condies de assepsia e anti-sepsia compatveis a ambiente ambulatorial. Antes da realizao da cirurgia, a paciente foi informada sobre o projeto e optou por participar do mesmo por livre e espontnea vontade, com consentimento informado (protocolo de pesquisa aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo - FOUSP, sob o parecer n. 33/99; vide apndice 1).

A amostra foi coletada, lavada em soro fisiolgico por duas vezes, e colocada num frasco de transporte contendo meio de cultivo Dulbeccos modified Eagle (DME) em temperatura ambiente. Aps 2 horas nesse meio de transporte, a amostra foi processada no Laboratrio de Cultivo Celular da Disciplina de Patologia Bucal da FOUSP.

4.1.2. Cultivo Primrio

Todos os procedimentos para a obteno do cultivo primrio de fibroblastos gengivais foram realizados sob capela de fluxo laminar, em temperatura ambiente entre 25 e 28 C.

A amostra coletada (que media 2,5 cm x 0,8 cm x 0,2 cm) foi processada em placas de Petri (de 60 mm de dimetro) contendo meio DME. A amostra foi fragmentada em pedaos diminutos (mdia de 0,1 mm2 cada pedao) com a ajuda de duas lminas 11 de bisturi tipo Bard-Paker.

Os fragmentos foram lavados duas vezes com soluo tampo fosfato-salina sem clcio e magnsio (PBSA), com pH 7,2 e posteriormente por soluo de tripsina a 0,25% em PBSA e 1% de EDTA para obter individualizao celular. Novamente foram lavados com PBSA e o lquido existente na placa de Petri foi aspirado com pipeta tipo Pasteur. Acrescentou-se 2 ml de meio DME sobre os fragmentos. Eles foram semeados, distribuindo-se a suspenso celular em quatro frascos de cultivo de 25 cm2 e incubados durante meia hora em estufa a 37C em atmosfera mida contendo 95% de ar e 5% de CO2, para favorecer sua adeso superfcie. Aps esse tempo foi adicionado meio DME fresco, contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de soluo antibitica-antimictica, cerca de 3 ml em cada frasco, o suficiente para recobrir esses fragmentos. Os frascos foram devidamente identificados, datados e levados estufa de cultivo com as tampas semi-abertas, para entrar CO2. Esses fragmentos de tecido que foram transplantados de seu stio original (explants), foram mantidos a partir da em meio artificial e foram incubados em incubadora com controle de temperatura e presso (Forma Scientific) em ambiente mido a 37C, em fluxo de 95% de ar e 5% de CO2.

Foram aguardadas 72 horas para a primeira observao dos explants. A monitorao do crescimento celular e de sua evoluo foi feita a cada 24 horas utilizando-se microscpio de observao direta (Axiovert 25), para deteco precoce de qualquer anomalia que pudesse fazer com que eles tornassem-se inviveis.

Aps 7 dias foi feita a primeira mudana de meio de cultivo dos frascos.

Uma vez que se iniciou o crescimento celular ao redor dos explants, o meio de cultivo foi renovado a cada trs dias. Para a troca de meio de cultivo todas as substncias (meio DME, PBSA, soluo de Tripsina e EDTA) utilizadas nesse procedimento foram previamente aquecidas em aparelho de Banho-Maria a 37C por 15 minutos, antes de comear a manipulao das clulas. Aps esse tempo, as substncias e as clulas foram levadas ao fluxo laminar. Todo o meio foi descartado, as clulas foram lavadas duas vezes com 2ml de PBSA e meio DME fresco foi colocado nos frascos. Foram utilizados frascos plsticos para cultivo de 25 cm2 de rea cultivvel, onde foram adicionados mais 3 ml de meio DME contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de soluo antibitica-antimictica.

O meio uma soluo composta de aminocidos essenciais, vitaminas e sais minerais, algumas vezes so suplementados por glicose e outros suplementos orgnicos (PAUL, 1975). A qualidade do meio de extrema importncia, j que ele ir manter as clulas em condies nutricionais semelhantes quelas que tinham quando estavam no organismo.

Sabemos que em cultura de fibroblastos, para que a diviso celular se realize em condies timas, necessrio que o meio de cultivo esteja em condies ideais de nutrio, isto , o meio ideal para essas clulas aquele que contenha 10% de soro fetal bovino (SFB), caso contrrio essas clulas entraro em estresse, e tero seu crescimento alterado de alguma forma. Por isso trabalhamos com meio DME contendo 10% de soro fetal bovino para o estabelecimento dessa linhagem primria.

Quando 70% do fundo do frasco estava coberto por clulas (a isso chamamos de subconfluncia) essa cultura primria foi subcultivada (Fig. 4.1).

A subcultura, ou passagem de clulas de um frasco para outros, geralmente implica em subdiviso de uma populao celular proliferativa capaz de perpetuao atravs de estabelecimento de uma linhagem celular. O nmero de passagem significa o nmero de vezes que uma cultura foi subcultivada.

A primeira subcultura foi feita no vigsimo dia aps a semeadura (esse procedimento denomina-se "plaqueamento") dos explants. Nessa fase, a expanso de clulas epiteliais estabilizou-se enquanto que os fibroblastos colonizaram progressivamente toda a superfcie dos frascos, formando uma monocamada celular subconfluente. Para a subcultura os fibroblastos foram suspensos pelo uso de soluo de tripsina a 0,25% em PBSA e 1% de EDTA1. Dessa forma realizou-se a separao dos fibroblastos dos explants, j que os explants com as clulas epiteliais, permaneciam mais tempo aderidos ao fundo dos frascos. Assim obteve-se a primeira passagem do cultivo primrio de fibroblastos e nesse momento, essa cultura primria deu origem a uma linhagem celular. A partir da foi estabelecida a linhagem celular denominada de LMF (iniciais da paciente).
 
 






Figura 4.1: Frasco de cultivo com 25 cm2 de rea cultivvel contendo as clulas em meio DME. A colorao alaranjada do meio de cultura demonstra a alterao do pH de 7,2 a 7,4 (pelo vermelho de fenol).

4.1.3. Linhagem Celular

As clulas passaram a crescer. A mudana de meio de cultivo deu-se entre dois e quatro dias.

A confluncia dos cultivos celulares foi verificada em microscpio de observao direta, quando se observou que a superfcie do frasco estava recoberta de uma monocamada contnua de clulas. A confluncia modula a atividade mittica das clulas. As clulas em cultivo sofrem um fenmeno que se conhece por inibio de contato, pois quando uma clula contata ao seu redor com outra clulas e forma-se uma monocamada, inibe-se o processo mittico (ALBERTS et al., 1989).

Para perpetuao dessa linhagem celular, essas clulas foram lavadas duas vezes com PBSA e levantadas de seu substrato pela ao de soluo de tripsina a 0,25% em PBSA e 1% de EDTA, durante 1 minuto a 37C (tripsinizao). O contedo de cada frasco foi removido, colocado em tubo de ensaio e centrifugado a 300g durante 5 minutos temperatura ambiente em centrfuga (Excelsa Baby, modelo 206)4. O sobrenadante dos tubos foi descartado e as clulas que formavam o precipitado no fundo do tubo de ensaio foram ressuspendidas com 4ml de meio fresco (meio DME, contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de soluo antibitica-antimictica). Em cada novo frasco foi depositado 1 ml dessa suspenso de clulas e acrescentado 3 ml de meio DME fresco. Esse procedimento indicou uma nova passagem celular.

Na 6 passagem amostras das clulas LMF foram congeladas para estocagem.

4.1.4. Congelamento e Descongelamento Celular

Para o congelamento foi utilizado o mtodo de tripsina EDTA que consiste em reproduzir os mesmos passos descritos para subcultura, com a variao de que, quando da ressuspenso, ao invs de deposit-la no frasco convencional para crescimento, cada 1 ml de suspenso celular foi colocado em um tubo criognico ou cryovial1, previamente identificado e datado.

Depois que os cryovials estavam todos completos, foi acrescentado 100 m l de substncia crioprotetora di-metil-sulfxido (DMSO)1, rapidamente fechados e colocados no gelo. Sua temperatura foi diminuda lentamente (em -20oC por 30 minutos, depois em freezer a - 70C overnight), at seu congelamento total. Ento as clulas foram armazenadas em freezer de nitrognio a -170oC.

Cada vez que se ia comear um novo experimento, parte das clulas estocadas eram descongeladas.

Para o descongelamento, uma cpsula cariognica contendo clulas foi descongelada rapidamente em banho-maria a 37C, agitando-o por 60 segundos. Para desativar a substncia crioprotetora (DMSO), o contedo do cryovail foi transferido rapidamente para um tubo de ensaio contendo 10 ml de meio de cultivo e centrifugado a 300g durante cinco minutos, temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e o precipitado foi ressuspendido em 1 ml de meio DME fresco e transferido para um frasco de plstico de 25 cm2 previamente identificado. Foi acrescentado 5 ml de meio DME, contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de soluo antibitica-antimictica. As clulas foram mantidas em estufa de cultivo e monitoradas at que se observou seu crescimento utilizando-se microscpio invertido de fase.

4.1.5. Contagem Celular

Antes de comear os experimentos foi necessrio fazer a determinao do nmero de clulas existentes no frasco original. A finalidade dessa determinao era conhecer o nmero de clulas existentes em cada tubo para poder fazer-se a semeadura nas placas de experimento com nmeros exatos de clulas nas placas, padronizando dessa forma os experimentos, da maneira mais precisa possvel.

Para a determinao do nmero de clulas existentes nos frascos originais (Contagem Celular), as clulas foram lavadas duas vezes com PBSA e levantadas de seu substrato utilizando soluo de tripsina a 0,25% em PBSA e 1% de EDTA. O contedo de cada frasco foi removido, colocado em tubo de ensaio e centrifugado. O sobrenadante dos tubos foi descartado e os precipitados foram ressuspendidos em 1 ml de PBSA e 0,1 ml dessa suspenso celular foi dispensada em um tubo de ensaio, sendo adicionado 0,8 ml de PBSA e 0,1 ml de Azul de Trypan1 a 0,4%. Fora do fluxo laminar, uma gota dessa mistura foi colocada em cada lado da Cmara de Neubauer, que foi levada ao microscpio invertido de fase para realizao da contagem do nmero de clulas. As clulas coradas em azul representavam as clulas mortas, enquanto que as clulas que no estavam coradas representavam as clulas viveis. Foram contados 25 quadrados na parte superior e 25 na parte inferior, perfazendo um total de 50 quadrados contados. O clculo de contagem foi obtido pela frmula onde o nmero total de clulas contadas (mortas e viveis) foi multiplicado pela diluio (nesse caso de 10, j que usamos 100 m l de uma suspenso celular de 1000 m l) e multiplicado por 104 (pelo volume contado que 0,1 mm3 ou 104 ml). Esse valor foi dividido pelo nmero de quadrados contados (50). A partir dessa frmula ento obtivemos a quantidade de clulas presentes em cada frasco.

O nmero total de clulas presentes no frasco foi obtido atravs da equao 4.1.

Equao 4.1:
No de clulas = No total de clulas contadas x diluio x 104
dividido por: No de quadrados usados para contagem

A suspenso restante (0,9 ml) foi centrifugada, o sobrenadante aspirado, e o precipitado ressuspendido em 1 ml de meio DME fresco. De acordo com a quantidade de clulas existentes, foi adicionado meio DME suficiente a essa suspenso para obter-se 1, 8 x 104 clulas em cada 100 m l. Essa nova suspenso de clulas foi novamente subcultivada em placas de 35 x 10 mm (Fig. 4.2) onde as clulas aderiram e cresceram. Para a manuteno da viabilidade das clulas a troca dos meios de cultivo das placas foi feita a cada dois ou trs dias. Aguardamos 24 horas aps o plaqueamento para comearmos os experimentos.





Figura 4.2: Placas de cultivo com 35 x 10 mm de rea cultivvel contendo as clulas que foram semeadas e divididas em 3 grupos e 9 subgrupos. Em cada contagem trs placas de cada subgrupo foram paradas e a contagem foi feita em triplicata.

4.2. Lasers Utilizados

  • Foi utilizado um nico aparelho de laser operando em baixa potncia, modelo IR 100 da Laser Beam, com comprimento de onda e potncia caractersticos para cada ponteira, sendo que a divergncia ptica foi corrigida sendo da ordem de 1mrad, ou seja, para a aplicao presente podemos considerar o feixe paralelo. Foram utilizadas quatro ponteiras, duas delas com diodos emitindo radiao no infravermelho prximo e duas com diodos emitindo radiao no visvel, com todas elas emitindo radiao contnua, a saber:
Laser 1 (L1) - Diodo Laser Visvel
  • l= 670nm, 10mW, rea do feixe = 0,01 cm2.
Laser 2 (L2) - Diodo Laser Infravermelho
  • l= 780nm, 50mW, rea do feixe = 0,01 cm2.
Laser 3 (L3) - Diodo Laser Visvel
  • l= 692nm, 30mW, rea do feixe = 0,01 cm2.
Laser 4 (L4) - Diodo Laser Infravermelho

l = 786nm, 30mW, rea do feixe = 0,01 cm2.

4.3. Grupos Experimentais

Para todos os experimentos foi utilizada a linhagem LMF.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados sob capela de fluxo laminar, e as clulas foram incubadas em estufas de cultivo a 37C, em atmosfera mida contendo 95% de ar e 5% de CO2.

O meio de cultivo utilizado foi meio DME, porm a quantidade de soro fetal bovino variava. Para lavagem das clulas era usada a soluo tampo de PBSA, pH 7,2 e para seu levantamento era utilizada soluo de tripsina a 0,25% em PBSA e 1% de EDTA.

Para os experimentos foi montado um sistema de aplicao onde o sistema ponteira laser e placa estivessem fixos. A ponteira do aparelho era colocada junto placa que recebia a irradiao de baixo para cima, diretamente sobre a monocamada celular, num ponto nico preestabelecido quando da fixao da ponteira no sistema. Dessa forma, as aplicaes foram feitas do lado de fora da placa, sem necessidade de abrir as tampas das mesmas para receberem a irradiao, diminuindo assim os riscos de contaminao das clulas.

O aparelho laser foi colocado fora do fluxo laminar, e suas ponteiras foram colocadas dentro do fluxo laminar, previamente esterilizadas em autoclave. Todas as placas foram colocadas dentro do fluxo laminar ao mesmo tempo, inclusive as placas controle, e assim permaneciam at que a ltima placa do ltimo grupo fosse irradiada. Assim sendo, todas as placas foram submetidas s mesmas condies de estresse. Quando chegava o momento da irradiao, as placas eram colocadas uma a uma no sistema e recebiam sua aplicao correspondente. A figura 4.3 ilustra esse esquema de aplicao.

As irradiaes foram feitas sempre da mesma forma, variando apenas o tempo de aplicao, em funo da irradincia, segundo o experimento. A fluncia recebida no centro de cada placa foi fixada em 2 J/cm2 por placa, utilizando-se para tanto o conceito SAEF (Spatial Average Energy Fluence). A tcnica de aplicao utilizada nos experimentos foi a tcnica puntual, ou seja, a irradiao foi feita em um nico ponto, sempre no centro da placa.

Para os grupos controle seguiram-se os mesmos processos de manipulao, simulando-se receber aplicao de laser, permanecendo fora da estufa de cultivo, com conseqente variao de temperatura, e em obscuridade parcial, sempre nas mesmas condies que os grupos irradiados.

Na figura 4.4 observamos o esquema de aplicao dentro do fluxo laminar.
 
 


 
 

Figura 4.4: Detalhe do esquema de aplicao dentro do fluxo laminar. A caixa contendo as placas servia para garantir condio de obscuridade parcial.

Experimento 1

Na 7 passagem as clulas foram tripsinizadas, centrifugadas, ressuspendidas em meio DME sem soro e semeadas em placas (plaqueamento) de 35 x 10 mm. A concentrao celular para o seguinte plaqueamento foi de 1,7 x 103 clulas/placa.

Utilizaram-se um total de 81 placas divididas aleatoriamente em 3 grupos de 27 placas, a saber:

Grupo A: meio DME sem soro fetal bovino

Grupo B: meio DME + 5% de soro fetal bovino

Grupo C: meio DME + 10% de soro fetal bovino

Foram utilizados o L1 e o L2 nos parmetros demonstrados na Tabela 4.1.

Tabela 4.1: Parmetros de irradiao de L1 e L2:

Energia total /sesso:
2 Joules
2 Joules
rea de irradiao
1 cm2
1 cm2
Tempo da irradiao/sesso
500 segundos
40 segundos
SAEF (dose/sesso)
2 J/cm2
2 J/cm2

A primeira irradiao realizou-se em campo escuro, 12 h aps o plaqueamento, quando havia confluncia de 50% na maioria das placas, e posteriormente a cada 12 h num total de 4 sesses com fluncia de 2 J/cm2 por sesso. Como foram utilizados dois diferentes diodos laser (L1, L2), dividimos os grupos em trs subgrupos correspondentes a:

GRUPO A1 = 9 placas = controle (sem irradiao)

A2 = 9 placas = irradiado com L1

A3 = 9 placas = irradiado com L2

Para os GRUPO B e C foram realizadas as mesmas subdivises.

A contagem celular, em triplicata, realizou-se s 48, 96 e 144 horas aps a 1 irradiao. Os dados obtidos foram tratados estatisticamente.

Experimento 2

Na 9 passagem as clulas foram tripsinizadas, centrifugadas, ressuspendidas em meio DME sem soro e semeadas em placas de 35 x 10 mm. A concentrao celular para o seguinte plaqueamento foi de 1,7 x 103 clulas/placa.

Utilizaram-se um total de 81 placas divididas aleatoriamente em 3 grupos de 27 placas, a saber:

Grupo A: meio DME sem soro fetal bovino

Grupo B: meio DME + 5% de soro fetal bovino

Grupo C: meio DME + 10% de soro fetal bovino

Foram utilizados o L3 e o L4 nos parmetros demonstrados na Tabela 4.2.

Tabela 4.2: Parmetros de irradiao de L3 e L4:

Energia total /sesso:
2 Joules
2 Joules
rea de irradiao
1 cm2
1 cm2
Tempo da irradiao/sesso
66 segundos
66 segundos
SAEF (dose/sesso)
2 J/cm2
2 J/cm2

A primeira irradiao realizou-se em campo escuro, 4 h aps o plaqueamento, quando havia confluncia de 50% na maioria das placas, e posteriormente a cada 12 h num total de 4 sesses com fluncia de 2 J/cm2 por sesso. Como foram utilizados dois diferentes diodos laser (L3, L4), dividiu-se os grupos em trs subgrupos correspondentes a:

GRUPO A1 = 9 placas = controle (sem irradiao)

A2 = 9 placas = irradiado com L3

A3 = 9 placas = irradiado com L4

Para os GRUPO B e C foram realizadas as mesmas subdivises.

A contagem celular, em triplicata, realizou-se s 48, 96 e 144 horas aps a 1 irradiao. Os dados obtidos foram tratados estatisticamente.

4.3.1. Curvas de Crescimento e de Viabilidade Celular

A contagem celular foi realizada para a obteno de curvas de crescimento e de viabilidade celular, com finalidade de anlise do efeito do laser sobre os fibroblastos.

Para o levantamento das clulas, as placas de cultivo foram lavadas duas vezes com PBSA e submetidas tripsinizao individualmente. O contedo de cada frasco foi removido, colocado em tubo de ensaio e centrifugado. O sobrenadante dos tubos foi aspirado e os precipitados foram ressuspendidos em 1 ml de PBSA e 0,1 ml dessa suspenso celular foi dispensada em um tubo de ensaio, sendo adicionado 0,8 ml de PBSA e 0,1 ml de Azul de Trypan a 0,4%1. Fora do fluxo laminar, uma gota dessa mistura foi colocada em cada lado da Cmara de Neubauer, que foi levada ao microscpio invertido de fase para realizao da contagem do nmero de clulas. Esse procedimento repetiu-se para cada placa estudada.

O nmero total de clulas foi registrado segundo a equao 4.1:

Equao 4.1:
No de clulas = No total de clulas contadas x diluio x 104
dividido por No de quadrados usados para contagem

A excluso das clulas coradas de azul, clulas mortas, da contagem geral serviu para a determinao do nmero de clulas viveis (equao 4.2) e da porcentagem de viabilidade celular (equao 4.3).

Equao 4.2:

No de clulas viveis = No total de clulas contadas (no coradas) x diluio x 104
dividido pelo No de quadrados usados para contagem

O percentual de viabilidade da populao celular foi obtido pela equao 4.3, segundo Freshney, 1990:

Equao 4.3: No total de clulas viveis x 100 dividido pelo No total de clulas

As suspenses celulares restantes (0,9 ml de cada placa contada) no utilizadas na contagem, foram descartadas com jato de lquido de Dakin.

4.3.2. Anlise Estatstica

Os pontos das curvas de crescimento e de viabilidade celular representavam a mdia +/- o erro da mdia da contagem de 3 placas para cada perodo experimental. Os dados obtidos foram comparados por teste estatstico de anlise de varincia e complementado pelo teste de Tukey (SNEDECOR & COCHRAN, 1967) para comparao entre mdias quando da presena de uma curva normal (Tabela 5.2 e 5.4). Foi aplicado o teste de Kruskal-Wallis (Gomes, 1990) quando da presena de uma curva no normal, utilizando-se programa de informtica (GMC Basic Software, verso 7,1 - Brasil) (Tabela 5.6). As diferenas estatsticas foram consideradas significantes ao nvel de 5% (p 0,05).



 

5. Resultados

5.1. Linhagem LMF

Foi desenvolvida a linhagem celular LMF, fibroblastos originados de gengiva humana.

A monitorao do crescimento foi feita macroscopicamente observando-se se havia alterao na colorao e viscosidade do meio de cultivo. A cor do meio, a cada 4 dias tornava-se mais amarelada, significando alto metabolismo celular como conseqncia do consumo de nutrientes do meio. A troca de meio foi feita em mdia a cada 4 dias.

Tambm foi feita monitorao por meio de microscpio de observao direta a cada dois dias de forma rotineira, e observou-se que os cultivos alcanavam 100% de confluncia a cada 7 dias. O crescimento dos cultivos foi uniforme e no foi verificado nenhum tipo de irregularidade nem contaminao (Tabela 5.1).

Tabela 5.1: Mdia da contagem celular para os diferentes grupos controles.

   
N clulas x 10 3+ erro da mdia
GRUPO
SFB
2 dias
4 dias
6 dias
A
0%
2,67 + 0,67
0,33 + 0,33
0 + 0
B
5%
4,00 + 1,15
31,00 + 7,69
35,33 + 6,28
C
10%
12,67 + 1,33
21,67 + 2,94
75,67 + 6,82

Tabela 5.2: Diferena entre mdias do nmero de clulas viveis (x 103) obtidas nos dias 2, 4 e 6 que no receberam irradiao, pelo teste de Kruskal-Wallis.
 

 
2 dias
4 dias
6 dias
Figura
Perodo

 

Grupo

Diferena entre mdias
p < 0,05
Diferena entre mdias
p < 0,05
Diferena entre mdias
p < 0,05
 
A x B
1,3333
NS
18,3333
S
16,5000
S
Fig. 5.1
A x C
5,5000
S
15,8333
S
23,0000
S
 
B x C
4,1667
S
2,5000
NS
6,5000
S

S = estatisticamente significante
NS = no significante

A figura 5.1 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME com diferentes concentraes de soro fetal bovino e que no receberam irradiao (Grupos controles A1, B1 e C1). Nos grupos com SBF a 5%, a diminuio da concentrao reduziu significativamente o crescimento celular a partir do quarto dia (p = 5%). Nos grupos com SBF a 0%, a falta de nutrientes levou morte celular a partir do 2 dia (p = 5%).

Figura 5.1: Observamos o crescimento celular das clulas LMF em meio DME com diferentes concentraes de soro fetal bovino.

Como modelo de estudo foi proposto o estabelecimento de uma linhagem primria de fibroblastos de gengiva humana. A morfologia das clulas obtidas a partir de fragmentos de gengiva foi similar a do fibroblasto, apresentando-se como clulas fusiformes ou estreladas conforme observa-se na figura 5.2.
 
 

Figura 5.2: Microscopia de fase onde podemos observar o aspecto de um cultivo controle em meio DME com 10% de soro fetal bovino. Clulas esto dispersas em pequeno nmero. Clulas em diviso so observadas (x 200).

A figura 5.3 apresenta a morfologia e distribuio de clulas LMF nos grupos irradiados aps 96 horas, depois da primeira irradiao.

Figura 5.3: Grupo com DME e 5% de soro fetal bovino irradiado aos 4 dias apresentando vrias clulas em diviso celular (x 100).

Figura 5.4: Grupo com DME e 10% de soro fetal bovino irradiado aos 6 dias. Observa-se grande tendncia a formao de feixes paralelos (x 200).

5.2. Experimento 1

A tabela 5.3 apresenta os nmeros de clulas viveis para diferentes tempos dos cultivos de clulas LMF irradiados com os lasers de l = 670nm (L1) e l = 780nm (L2) e tambm para os controles no irradiados. Neste caso, para ambos os lasers utilizamos a mesma fluncia.

Tabela 5.3: Mdia da contagem celular para os diferentes grupos

     
N clulas x 103 + erro de mdia
GRUPO
LASER
SFB
4 dias
6 dias
A-1
controle
0%
0 + 0
0 + 0
A-2
L1
0%
2 + 1,15
0 + 0
A-3
L2
0%
7,33 + 1,76
1,33 + 0,66
B-1
controle
5%
14 + 3,46
27 + 4,66
B-2
L1
5%
38,66 + 1,76
40,66 + 1,33
B-3
L2
5%
47,33 + 1,33
48,66 + 3,71
C-1
Controle 
10%
16 + 2,3
72 + 13,53
C-2
L1
10%
35,33 + 3,71
100,66 + 5,92
C-3
L2
10%
37,00 + 4,72
96,00 + 8,08

SFB = soro fetal bovino

Tabela 5.4: Diferena entre mdias do nmero de clulas viveis (x 103) obtidas nos dias 4 e 6 aps a irradiao, pelo teste de Kruskal-Wallis.
 

 
4 dias
6 dias
Figuras
Perodo

 

Grupo

Diferena entre mdias
p < 0,05
Diferena entre mdias
p < 0,05
 
A1 x A2
6,1667
S
2,0000
NS
 
A1 x A3
12,0000
S
5,3333
NS
 
A1 x B1
17,6667
S
18,6667
S
 
A1 x B2
28,1667
S
30,6667
S
 
A1 x B3
38,3333
S
37,3333
S
 
A1 x C1
18,1667
S
41,5000
S
 
A1 x C2
26,6667
S
46,6667
S
 
A1 X C3
28,3333
S
45,6667
S
 
A2 x A3
5,8333
NS
3,3333
NS
 
A2 x B1
11,5000
S
16,6667
S
 
A2 x B2
22,0000
S
28,6667
S
 
A2 x B3
32,1667
S
35,3333
S
 
A2 x C1
12,0000
S
39,500
S
A2 x C2
20,5000
S
44,6667
S
 
A2 x C3
22,1667
S
43,6667
S
 
A3 x B1
5,6667
NS
13,3333
S
 
A3 x B2
16,1667
S
25,3333
S
 
A3 x B3
26,3333
S
32,0000
S
 
A3 x C1
6,1667
S
36,1667
S
 
A3 x C2
14,6667
S
41,3333
S
 
A3 x C3
16,3333
S
40,3333
S
 
B1 x B2
10,5000
S
12,0000
S
 
B1 x B3
20,6667
S
18,6667
S
 
B1 x C1
0,5000
NS
22,8333
S
 
B1 x C2
9,0000
S
28,0000
S
 
B1 x C3
10,6667
NS
27,0000
S
 
B2 x B3
8,6667
S
8,000
S
 
B2 x C1
10,0000
S
10,8333
S
 
B2 x C2
1,5000
NS
16,0000
S
 
B2 x C3
0,1667
NS
15,0000
S
 
B3 x C1
20,1667
S
4,1667
NS
 
B2 x C2
11,6667
S
9,3333
S
 
B3 x C3
10,0000
S
8,3333
S
 
C1 x C2
21,0000
S
28,6666
S
 
C1 x C3
19,3333
S
24,6666
S
 
C2 x C3
1,6667
NS
1,0000
NS

As curvas de crescimento referentes aos experimentos realizados com os lasers L1 e L2 esto representadas nas figuras de 5.5 a 5.9, segundo a tabela 5.4.

A figura 5.5 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME sem soro fetal bovino. Os cultivos que no receberam irradiao (controles) apresentaram diminuio do nmero de clulas viveis a partir da irradiao, culminando na morte de todas as clulas aos 4 dias aps a primeira irradiao. Quando irradiados pelo laser L1 houve uma manuteno do nmero de clulas viveis at 4 dias aps irradiao e morte de todas as clulas aos 6 dias. O laser L2 produziu um aumento significativo (p = 0,1%) do nmero de clulas viveis atingindo 7,33 x 103 1,76 clulas no quarto dia aps irradiao, porm aos 6 dias quase a totalidade das clulas morreram (1,33 x 103 0,66).

Figura 5.5: Crescimento de clulas LMF viveis cultivadas em meio DME sem soro fetal bovino e irradiadas com os lasers L1 e L2.

A figura 5.6 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME contendo 5% de soro fetal bovino. Os cultivos no irradiados (controles) apresentaram aumento do nmero de clulas viveis atingindo 27 x 103 4,66 clulas aos 6 dias aps irradiao. Quando irradiados pelo laser L1 houve um aumento significativo (p = 0,1%) do nmero de clulas viveis em relao ao controle atingindo 40,66 x 103 1,33 aos 6 dias aps irradiao. O laser L2 tambm produziu aumento significativo (p = 0,1%) do nmero de clulas viveis atingindo 48,66 x 103 3,71 aos 6 dias. Houve diferena significativa (p = 1%) aos 4 dias e aos 6 dias (p = 1%) entre as curvas de crescimento das culturas irradiadas.


 
 

Figura 5.6: Crescimento de clulas LMF viveis cultivadas em meio DME contendo 5% de soro fetal bovino e irradiadas com os lasers L1 e L2.

A figura 5.7 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME contendo 10% de soro fetal bovino. Os cultivos que no receberam irradiao (controles) apresentaram aumento do nmero de clulas viveis atingindo 72 x 103 13,53 clulas aos 6 dias aps irradiao. Quando irradiados pelo laser L1 houve um aumento significativo do nmero de clulas viveis em relao ao controle at o quarto dia (35,33 x 103 3,71) e at o 6 dia (100,66 x 103 5,92) aps a irradiao. A irradiao com o laser L2 tambm produziu aumento significativo do nmero de clulas viveis em relao ao controle at o quarto dia (37 x 103 4,72) e at o 6 dia (96 x 103 8,08) aps a irradiao. Os lasers L1 e L2 promoveram praticamente o mesmo crescimento celular no havendo portanto diferena significativa entre as curvas de crescimento das culturas irradiadas.


 
 

Figura 5.7: Crescimento de clulas LMF viveis cultivadas em meio DME contendo 10% de soro fetal bovino e irradiadas com os lasers L1 e L2.

A figura 5.8 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME contendo diferentes concentraes de soro fetal bovino as quais receberam irradiao com o laser L1. Os grupos que estavam em DME sem soro fetal bovino apresentaram manuteno inicial do nmero de clulas viveis at 4 dias aps irradiao, e morte entre 4 e 6 dias. Os grupos que estavam em DME com 5% de soro fetal bovino apresentaram aumento linear do nmero de clulas viveis entre o primeiro e o quarto dia e um pequeno decrscimo da taxa de crescimento entre o 4 e o 6 dia aps irradiao. Os grupos que estavam em DME com 10% de soro fetal bovino tambm apresentaram aumento linear do nmero de clulas viveis entre o 1 e o 4 dia e significativo aumento da taxa de crescimento entre o 4 e o 6 dia aps irradiao. At o 4 dia os grupos irradiados com qualquer concentrao de soro fetal bovino apresentaram crescimento similar, sendo que os grupos com 5% de SFB atingiram 38,66 x 103 + 1,76 clulas e os grupos com 10% de SFB atingiram a quantidade de 35,33 x 103 3,71 clulas, no havendo portanto diferena significativa entre estes dois grupos neste perodo. Entre o 4 e o 6 dia, o primeiro grupo (5%) continuou crescendo atingindo 47,33 x 103 1,33 clulas, enquanto que o segundo grupo (10%) atingiu 100,66 x 103 5,92 clulas no sexto dia.


 
 

Figura 5.8: Crescimento de clulas LMF viveis cultivadas em meio DME contendo diferentes concentraes de soro fetal bovino e irradiadas com o laser L1.

A figura 5.9 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME contendo as diferentes concentraes de soro fetal bovino as quais receberam irradiao com o laser L2. As curvas de crescimento apresentadas neste grfico so similares s do grfico da figura 5.8, exceto pela diferena significativa apresentada no 4 dia entre os grupos com 5% e 10% de SFB.
 
 


 
 

Figura 5.9: Crescimento de clulas LMF viveis cultivadas em meio DME contendo diferentes concentraes de soro fetal bovino e irradiadas com o laser L2.

5.2. Experimento 2

A tabela 5.5 apresenta os nmeros de clulas viveis para diferentes tempos dos cultivos de clulas LMF irradiados com os lasers de l = 692nm (L3) e l = 786nm (L4) e tambm para os controles no irradiados. Neste caso a potncia ptica de sada dos lasers foram iguais, assim como a fluncia e a irradincia aplicada sobre as amostras.

Tabela 5.5: Mdia da contagem celular para os diferentes grupos.

     
N clulas x 103 + erro de mdia
GRUPO
LASER
SFB
2 dias
4 dias
6 dias
A-1
Controle
0%
2,67 + 0,67
0,67 + 0,67
0 + 0
A-2
L3
0%
15,33 + 1,76
8,67 + 2,4
2,67 + 0,67
A-3
L4
0%
8,67 + 1,76
4 + 1,15
1,33 + 0,67
B-1
Controle
5%
4 + 1,15
14,67 + 5,4
22 + 2,31
B-2
L3
5%
26 + 3,46
54 + 2,31
70 + 6,11
B-3
L4
5%
16 + 1,15
40 + 3,46
54,67 + 4,6
C-1
Controle 
10%
12,67 + 1,33
27,33 + 2,40
78,67 + 6,36
C-2
L3
10%
27,33 + 0,67
42 + 5,03
88 + 6,11
C-3
L4
10%
22 + 3,46
36 + 4,16
86 + 5,03
SFB = soro fetal bovino

Tabela 5.6: Diferena entre mdias do nmero de clulas viveis obtidas nos dias 2, 4 e 6 aps a irradiao, pelo teste de Tukey.
 

 
2 dias
4 dias
6 dias
Figuras
Perodo

 

Grupo

Diferena entre mdias
p > 13,2666
Diferena entre mdias
p > 13,2666
Diferena entre mdias
p > 13,2666
 
A1 x A2
12,6667
NS
8,0000
NS
2,6666
NS
 
A1 x A3
6,0000
NS
3,3334
NS
1,3333
NS
 
A1 x B1
1,3334
NS
14,0000
S
22,0000
S
 
A1 x B2
23,3334
S
53,3334
S
70,0000
S
 
A1 x B3
12,6667
NS
39,3334
S
54,6666
S
 
A1 x C1
10,0000
NS
26,6667
S
78,6666
S
 
A1 x C2
24,6667
S
41,3334
S
88,0000
S
 
A1 X C3
19,3334
S
35,3334
S
86,0000
S
 
A2 x A3
6,6667
NS
4,6666
NS
1,3333
NS
 
A2 x B1
11,3333
NS
6,0000
NS
19,3334
S
 
A2 x B2
10,6667
NS
45,3334
S
67,3334
S
 
A2 x B3
0,0000
NS
31,3334
S
52,0000
S
A2 x C1
2,6667
NS
18,6667
S
76,0000
S
 
A2 x C2
12,0000
NS
33,3334
S
85,3334
S
 
A2 x C3
6,6667
NS
27,3334
S
83,3334
S
 
A3 x B1
4,6666
NS
10,6666
NS
20,6667
S
 
A3 x B2
17,3334
S
50,0000
S
68,6667
S
 
A3 x B3
6,6667
NS
36,0000
S
53,3333
S
 
A3 x C1
4,0001
NS
23,3333
S
77,3333
S
 
A3 x C2
18,6667
S
38,0000
S
86,6667
S
 
A3 x C3
13,3334
S*
32,0000
S
84,6667
S
 
B1 x B2
22,0000
S
39,3334
S
48,0000
S
 
B1 x B3
11,3333
NS
25,3334
S
32,6666
S
 
B1 x C1
8,6666
NS
12,6667
NS
56,6666
S
 
B1 x C2
23,3333
S
27,3334
S
66,0000
S
 
B1 x C3
18,0000
S
21,3334
S
64,0000
S
 
B2 x B3
10,6667
NS
14,0000
S
15,3334
S
 
B2 x C1
13,3334
S*
26,6667
S
8,6666
NS
 
B2 x C2
1,3333
NS
12,0000
NS
18,0000
S
 
B2 x C3
4,0000
NS
18,0000
S
16,0000
S
 
B3 x C1
2,6667
NS
12,6667
NS
24,0000
S
 
B2 x C2
12,0000
NS
2,0000
NS
33,3334
S
 
B3 x C3
6,6667
NS
4,0000
NS
31,3334
S
 
C1 x C2
14,6667
S
14,6667
S
9,3334
NS
 
C1 x C3
9,3334
NS
8,6667
NS
7,3334
NS
 
C2 x C3
5,3333
NS
6,0000
NS
2,0000
NS

As curvas de crescimento referentes aos experimentos realizados com os lasers L3 e L4 so apresentadas nas figuras 5.10 5.14, segundo a tabela 5.6.

A figura 5.10 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME sem soro fetal bovino. Os cultivos no irradiados (controles) apresentaram desde o tempo zero, diminuio do nmero de clulas viveis culminando na morte de todas as clulas aos 4 dias aps a irradiao. Quando irradiados pelo laser L3, pde-se observar no segundo dia um aumento significativo do nmero de clulas viveis (15,33 x 103 1,76), quando comparado ao grupo controle (2,67 x 103 0,67. Aps este valor mximo, o nmero de clulas decresceu atingindo 8,67 x 103 2,4 no 4 dia e 2,67 x 103 0,67 no 6 dia. O laser L4 provocou um aumento, porm no significativo do nmero de clulas viveis quando comparado ao grupo controle, chegando a atingir 7,33 x 103 1,76. Aos 4 dias observou-se um decrscimo do nmero de clulas viveis, atingindo 4 x 103 1,15 e aos 6 dias a morte da quase totalidade das clulas (1,33 x 103 0,67). No houve diferena significativa entre os grupos irradiados com diferentes comprimentos de onda.

Figura 5.10: Crescimento de clulas LMF viveis cultivadas em meio DME sem soro fetal bovino e irradiadas com os lasers L3 e L4.

A figura 5.11 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME contendo 5% de soro fetal bovino. Os cultivos no irradiados (controles) apresentaram aumento do nmero de clulas viveis atingindo 22 x 103 2,31 clulas aos 6 dias aps irradiao. Quando irradiadas pelo laser L3 houve um aumento significativo do nmero de clulas viveis em relao ao grupo controle atingindo 70 x 103 6,11clulas aos 6 dias aps irradiao. O laser L4 tambm provocou aumento significativo do nmero de clulas viveis atingindo 54,67 x 103 4,67 clulas aos 6 dias. Houve diferena significativa entre as curvas de crescimento das culturas irradiadas.

Figura 5.11: Crescimento de clulas LMF viveis cultivadas em meio DME contendo 5% de soro fetal bovino e irradiadas com os lasers L3 e L4.

A figura 5.12 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME contendo 10% de soro fetal bovino. Os cultivos no irradiados (controles) apresentaram aumento do nmero de clulas viveis atingindo 78,67 x 103 6,36 clulas aos 6 dias aps irradiao. Quando irradiados pelo laser L3 no houve aumento significativo do nmero de clulas viveis em relao ao grupo controle atingindo aos 6 dias, 88 x 103 6,11 clulas. O laser L4 tambm no provocou aumento significativo do nmero de clulas viveis em relao ao controle, atingindo aos 6 dias 86 x 103 5,03 clulas. No houve diferena estatisticamente significativa entre as curvas de crescimento dos grupos irradiados em relao ao grupo controle, nem entre os grupos irradiados com diferentes comprimentos de onda.

Figura 5.12: Crescimento de clulas LMF viveis cultivadas em meio DME contendo 10% de soro fetal bovino e irradiadas com os lasers L3 e L4.

A figura 5.13 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME contendo diferentes concentraes de soro fetal bovino as quais foram irradiadas com o laser L3. Os grupos em DME sem soro fetal bovino apresentaram aumento do nmero de clulas viveis aos 2 dias atingindo 15,33 x 103 1,76 clulas, aps esse valor mximo, o nmero de clulas decresceu atingindo no 6 dia seu valor mnimo com 2,67 x 103 0,67 clulas. Os grupos em DME com 5% de soro fetal bovino apresentaram aumento do nmero de clulas viveis entre o 1 e o 6 dia aps irradiao, com pequena reduo da taxa de crescimento entre o 4 e o 6 dia. Os grupos em DME com 10% de soro fetal bovino apresentaram aumento do nmero de clulas viveis entre o 1 e o 6 dia aps irradiao, com aumento da taxa de crescimento aps o 4 dia. Os grupos com SFB apresentaram nmero de clulas similares at o 2 dia; entre o 2 e o 5 dia a taxa de crescimento do grupo com 5% de SFB foi maior, sendo superado pelo grupo com 10% de SFB aps este perodo. No houve diferena significativa entre as curvas de crescimento das culturas irradiadas com SFB. Houve diferena significativa entre os grupos com SFB e sem SFB aos 6 dias.

Figura 5.13: Crescimento de clulas LMF viveis cultivadas em meio DME contendo diferentes concentraes de soro fetal bovino e irradiadas com o laser L3.

A figura 5.14 apresenta as curvas de crescimento de clulas LMF cultivadas em meio DME contendo diferentes concentraes de SFB, as quais receberam irradiao com o laser L4. Os grupos em DME sem soro fetal bovino apresentaram pequeno aumento do nmero de clulas viveis aos 2 dias atingindo 8,67 x 103 1,76 clulas, aps esse perodo o nmero decresceu, atingindo aos 6 dias 1,33 x 103 0,67 clulas. Os grupos em DME com 5% de SFB apresentaram aumento do nmero de clulas viveis aproximadamente constante entre o 1 e o 6 dia aps irradiao. Os grupos em DME com 10% de soro fetal bovino apresentaram aumento do nmero de clulas viveis quase constante at o 4 dia, e aps este perodo um aumento na taxa de crescimento. Os grupos com concentrao de SFB no apresentaram diferena significativa entre si at o quarto dia sendo que no final deste perodo, o grupo com 5% de SFB apresentou 40 x 103 3,46 clulas e o grupo com 10% de SFB, 36 x 103 4,16 clulas. Aos 6 dias o grupo com 5% de SFB apresentou menor nmero de clulas, atingindo 54,67 x 103 4,67, enquanto que o grupo com 10% de SFB apresentou nmero significativamente maior, atingindo 86 x 103 5,03 clulas. Houve diferena significativa entre os grupos com SFB e sem SFB aos 6 dias.

Figura 5.14 Crescimento de clulas LMF viveis cultivadas em meio DME contendo diferentes concentraes de soro fetal bovino e irradiadas com o laser L4.



 

6. Discusso

6.1. Aspectos Gerais do Laser de Baixa Potncia

A bioestimulao com laser de baixa potncia comeou na Hungria com MESTER (1966) e a partir da at a dcada de 80, foram reportados vrios experimentos in vivo que visavam a estimulao do processo de cicatrizao de feridas e estudos em modelos usando feridas e queimaduras em pele e mucosa de animais (BIHARI et al., 1989; ABERGEL et al., 1988; MESTER e MESTER, 1989). Os primeiros estudos foram feitos in vivo e concluam que o laser de baixa potncia afetava o processo metablico celular e aumentava o potencial regenerativo dos tecidos biolgicos (DYSON e YOUNG, 1982; TRELLES e MESTER, 1984; ABERGEL et al., 1987; TERRIBILE et al., 1988; YEW et al., 1989), tinha efeito antiinflamatrio e sobre o sistema linftico (LIEVENS, 1986; 1988; TRELLES et al., 1988; 1989a; 1989b; EL SAYED et al., 1990), analgsico (WALKER, 1983; HERRERO, 1988; HANSSON, 1989) e vasodilatador (BENEDICENTI, 1982; TRELLES, 1983; MAYAYO e TRELLES, 1984; MIR et al., 1984; KUBOTA e OHSHIRO, 1989).

Muitos desses trabalhos demonstravam os efeitos do laser de baixa potncia e o reconheciam como teraputico, entretanto, os autores ainda no conseguiam explicar completamente sua ao, sobretudo quando lhe atriburam uma importante ao sistmica (MESTER, 1977; WALKER, 1983; TRELLES et al., 1983; RUFFOLO, 1985; ANNEROTH et al., 1988; ROCHKIND et al., 1989).

Havia a necessidade, todavia, de serem feitos experimentos onde se trabalhassem com modelos mais especficos como clulas, ou grupo delas, isoladamente dentro de um determinado processo complexo, como a cicatrizao por exemplo, e assim se pudesse chegar a resultados mais conclusivos. Foi quando comearam a aparecer trabalhos in vitro, com modelos em cultura de clulas, buscando dessa forma maior facilidade para fixao de parmetros e limitao de variveis nesses experimentos (POURREAU-SCHNEIDER et al., 1989; 1990; YOUNG et al., 1990; KARU et al., 1991a; 19991b; 1991c; 1991d; BOLTON et al., 1991; 1992; FUNK et al., 1992; LUBART et al., 1992a; 1993; 1995).

partir do final da dcada de 80, muitos autores e suas equipes como KARU e LUBART, passaram a buscar exaustivamente explicaes para a elucidao dos mecanismos de ao do laser de baixa potncia (KARU, 1985; 1987; 1988; 1989; 1990; 1991a; 1991b; 1991c; 1991d; FRIEDMAN e LUBART, 1992; 1996; LUBART et al., 1992b; 1993; 1995; 1996; 1997).

Sabia-se que clinicamente esses lasers no apresentavam ao quando aplicados em rgos em condio de normalidade, e estudos in vivo demonstraram que no havia alterao significativa nos resultados obtidos em tecidos em homeostase quando irradiados (EL SAYED e DYSON, 1990).

A partir do incio dessa dcada, pode-se concluir que em modelos de estudo onde se estabeleceu condio de homeostase, no houve efeito significativo do laser (NARA et al., 1991; HEIN et al., 1992; WEI YU et al., 1994; Rigau, 1996; POGREL et al., 1997; ALMEIDA-LOPES et al., 1998b).

Os lasers emitindo na regio do visvel foram os mais utilizados na terapia de cicatrizao de feridas, desde MESTER (1966), mas com o advento dos diodos lasers semicondutores os clnicos comearam a trabalhar principalmente com comprimentos de onda emitidos no infravermelho prximo, devido ao baixo custo desses equipamentos. KARU, em 1988, sugeriu um mecanismo de ao diferente para os comprimentos de onda emitidos no visvel e no infravermelho prximo, j que alguns autores tinham observado in vitro diferenas significativas quando trabalharam com ambos (ABERGEL et al., 1986; LAN et al., 1986). Com o passar do tempo, essas diferenas de resultados foram confirmadas in vitro por outros grupos de pesquisadores (YOUNG et al., 1989; NARA et al., 1992; LUBART et al., 1992a; 1995; LOEVSCHALL e ARENHOLT-BINDSLEV, 1994; ALMEIDA-LOPES et al., 1998b), e in vivo em modelos animais (AL-WATBAN e ZHANG, 1996), ainda que alguns autores no tenham observado variao nos resultados quando estudos clnicos em pacientes foram feitos (ALMEIDA-LOPES et al., 1999; RODRIGUES et al., 1999).

claramente observado nos dados da literatura que os efeitos do laser foram dose-dependentes (GIMENEZ e CASADO, 1985; SHIROTO et al., 1989; CHIO et al., 1990; YOUNG et al., 1990; GROSS e JELKMANN, 1990; FUNK et al., 1992; LUBART et al., 1992a; KARU et al., 1995; 1996; 1997). Parmetros de irradiao, como fluncia e irradincia foram altamente relevantes para a obteno de bons resultados. Os efeitos do laser de baixa potncia dependeram da fluncia in vitro (RICEVUTI et al., 1989; LUBART et al., 1992a; VAN BREUGEL e br, 1992; KARU et al., 1996; KARU et al., 1997) e in vivo (AL-WATBAN e ZHANG, 1994; OSTUNI et al., 1994; SKINNER et al., 1996; LUBART et al., 1992b; 1996; 1997) e sua influncia dependeu da fase do crescimento celular e do estado fisiolgico em que a clula encontrava-se no momento da irradiao (NARA et al., 1991; HUG e HUNTER, 1991; STEINLECHNER e DYSON, 1993; KARU et al.,1995; RIGAU, 1996; GROSSMAN et al., 1998), bem como da freqncia e nmero de irradiaes (POURREAU-SCHNEIDER et al., 1989; SKINNER et al., 1996), j que uma nica irradiao no mostrou ser suficiente para a obteno de algum efeito celular (POGREL et al., 1997).

A fluncia administrada, 2 J/cm2, para reparao e cicatrizao de feridas em pele e mucosa comprovou-se eficaz em diferentes trabalhos clnicos e laboratoriais (Mester, 1986; 1989; Trelles, 1989a; WEI Yu, 1994; BOLTON et al., 1991; 1992; 1995; SKINNER et al., 1996; WEBB et al., 1998; Almeida-Lopes, 1998b; ALMEIDA-LOPES, 1999) e que em nosso caso corrobora os resultados obtidos.

Fluncias muito mais altas que a preconizada pela literatura inibiram a proliferao celular (OHTA et al., 1987; WEI YU et al., 1994; AL-WATBAN e ZHANG, 1995; BOLTON et al., 1995; LOWE et al., 1998; OCAA-QUERO et al., 1998) enquanto que fluncias muito baixas no apresentaram nenhum tipo de ao (NARA et al., 1992; BOLTON et al., 1995; IN DE BRAEKT et al., 1991; HALL et al., 1994; CHELYSHEV e KUBITSKY, 1995; LOWE et al., 1998).

Para a obteno de uma ao teraputica do laser de baixa potncia, no foi necessria a irradiao direta do tecido alvo, em muitos estudos in vivo apresentados (WAN et al., 1981; RODRIGO et al., 1985; TRELLES e MAYAYO, 1987; ROCHKIND et al., 1989), j que a irradiao do laser, ainda que local, comprovadamente induz importantes efeitos sistmicos.

O efeito estimulativo do laser de baixa potncia na proliferao de clulas in vitro e na cicatrizao tecidual in vivo no foi significativo quando clulas e tecidos encontravam-se em condies ideais de crescimento e manuteno, j que o tempo fisiolgico do ciclo celular foi respeitado (HEIN et al., 1992; NARA et al., 1991; HEIN et al., 1992; LOEVSCHALL e ARENHOLT-BINDSLEV, 1994; Ocaa-Quero et al., 1998).

Trabalhos com clulas in vitro submetidas a algum tipo de condio de estresse, por exemplo dficit nutricional, evidenciaram proliferao significativa nos grupos irradiados com algum tipo de laser de baixa potncia (RYHANEN et al., 1982; NARA et al., 1991; STEINLECHNER e DYSON, 1993; ALMEIDA-LOPES et al., 1998b).

O mecanismo de ao do laser no processo de reparao e cicatrizao tecidual ainda no est totalmente esclarecido, entretanto, no h dvida que a radiao laser aumenta o Ca2+ intra-celular (YOUNG et al., 1990; KARU, 1991d; FRIEDMAN e LUBART, 1992; 1996; LUBART et al., 1992b; 1996; 1997; GROSSMAN et al., 1998; LAVIE et al., 1999).

6.2. o Experimento com Clulas lmf

Estabelecemos uma linhagem a partir de cultivo primrio de fibroblastos de gengiva humana, denominada LMF. Para simular condio de estresse celular, propusemos um modelo onde o cultivo estivesse privado parcialmente de nutrientes, ou seja, estivesse em meio DME com quantidade insatisfatria de fatores de crescimento. Observamos durante o crescimento do cultivo que, em condies ideais de nutrio (DME+ 10% de SFB), a diviso celular realizou-se em condies timas; ento nos grupos irradiados o efeito estimulativo dos lasers utilizados, com a fluncia administrada, foi baixo e no significativo. Por outro lado, com os cultivos em condies insuficientes de nutrio (DME + 5% de SFB), a diviso celular ocorreu em condio de estresse, aqui demonstramos que a irradiao com laser produziu um efeito bioestimulativo. Na condio de extrema desnutrio (DME + 0% de SFB) era esperado bito celular em 48 horas, porm isso aconteceu somente nos grupos controle. Verificamos ainda que, quando os parmetros de irradiao foram diferentes a resposta celular foi igualmente diferente. Observamos que, mesma fluncia e irradincia diferente, com conseqente diferena no tempo de irradiao entre os grupos irradiados, aumentou a proliferao celular com diferena estatisticamente significativa para ambos os grupos em relao ao controle, com resultados mais efetivos para radiao no infravermelho.

Irradiaes de clulas em cultivo com parmetros idnticos (mesma fluncia e irradincia), evidenciou proliferao celular tanto para comprimento de onda no visvel como no infravermelho, com resultados mais efetivos para radiao no visvel.

Nossos resultados so corroborados por outros estudos in vivo que usaram como modelo mucosa animal (KUSAKARI et al., 1992; GMEZ-VILLAMANDOS et al., 1995; 1997; CRESPI et al., 1997) ou mucosa humana (ALMEIDA-LOPES et al., 1999; RODRIGUES et al., 1999) e estudos in vitro (PORREAU-SCHNEIDER et al., 1989; 1990; LOEVSCHALL e ARENHOLT-BINDSLEV, 1994; Almeida-Lopes, 1998b). Ressalta-se ainda, que os demais trabalhos no foram realizados com fibroblastos de origem oral, que tm comportamento diferente daqueles de origem cutnea.

Obtivemos uma linhagem celular atravs do mtodo de disperso enzimtica de tecido gengival normal. As clulas cultivadas foram analisadas por meio de mtodos morfolgicos e funcionais e caracterizados como fibroblsticas diferenciadas, ou fibroblastos.

A formao da linhagem celular, denominada LMF, foi originada a partir de cultivo primrio de fragmentos de gengiva humana normal e livre de enfermidade. Podemos afirmar que a linhagem foi obtida uma vez que houve um aumento do nmero total de clulas atravs de diversas geraes e a populao celular predominante apresentou grau de uniformidade (FRESHNEY, 1990).

Os fibroblastos crescem e desenvolvem-se optimamente in vitro quando esto em condies ideais de temperatura, presso e fatores nutricionais e de crescimento em seu meio de cultivo ideal para fibroblastos aquele cuja concentrao de soro fetal bovino seja de 10% (PAUL, 1993). Tratamos ento todos os grupos em condies ideais de temperatura, presso e umidade e variamos a condio nutricional dos meios de 4 cultivos. Havia um grupo controle com meio DME com 10% de soro fetal bovino, que seria o grupo em condies ideais. Propusemos um modelo de estudo cujos cultivos estivessem com meios em diferentes condies nutricionais, ou seja, diferentes concentraes de soro fetal bovino. Um grupo foi tratado com meio DME com 5% de soro fetal bovino, simulando uma condio de estresse; e outro grupo com meio DME sem soro fetal bovino, simulando uma condio de absoluta deficincia nutricional. A diminuio da concentrao de soro fetal bovino no meio diminuiu significativamente o crescimento celular. Nos grupos sem soro fetal bovino o controle no apresentou crescimento algum.

A utilizao de meio com concentrao de 5% de soro fetal bovino mostrou ser um modelo ideal para a anlise da ao do laser de baixa potncia, j que o crescimento celular diminui proporcionalmente concentrao de soro. A utilizao de meio sem soro fetal bovino mostrou ser um modelo no ideal para anlise da ao do laser de baixa potncia, j que em 144 horas todos os cultivos morreram, controles e irradiados.

Experimento 1

Os grupos irradiados contendo 10% de soro fetal bovino no apresentaram diferena significativa entre si.

Para os grupos em condies de dficit nutricional com 5% de soro fetal bovino, observamos diferena significativa no nmero total de clulas entre os grupos irradiados e entre os irradiados e o controle. Houve maior proliferao celular nos grupos irradiados com o laser emitindo radiao no infravermelho prximo.

De forma a manter a mesma fluncia (2J/cm2) para os dois lasers, o laser operando em 670 nm com potncia nominal de 4 mW, irradiou os cultivos por um perodo de 8,3 minutos, enquanto que o laser operando em 780 nm e potncia nominal de 50 mW, irradiou os cultivos por um perodo de 0,7 minutos.

Para os grupos em condio de dficit nutricional absoluto, sem soro fetal bovino, observamos diferena significativa no nmero total de clulas entre os grupos irradiados e entre os irradiados e o controle at os 4 dias; depois desse perodo no houve diferena significativa, j que todos morreram.

Experimento 2

Os grupos irradiados contendo 10% de soro fetal bovino no apresentaram diferena significativa entre si e entre os irradiados e os controle.

Para os grupos em condies de dficit nutricional com 5% de soro fetal bovino, observamos diferena significativa no nmero total de clulas entre os grupos irradiados e entre os irradiados e o controle. Houve maior proliferao celular nos grupos irradiados com o laser emitindo radiao no visvel.

Neste caso como as potncias nominais dos dois lasers utilizados (l = 692 nm e 786 nm) eram iguais a 30 mW, para manter a fluncia igual a 2J/cm2, utilizamos tempo de exposio igual a 1,1 minutos, para ambos lasers.

Para os grupos em condies de dficit nutricional absoluto, sem soro fetal bovino, observamos diferena significativa no nmero total de clulas entre os grupos irradiados e entre os irradiados e o controle at os 4 dias; depois desse perodo no houve diferena significativa, j que todos morreram.

Experimento 1 e 2

No modelo proposto com condio de dficit nutricional parcial (5% SFB) a aplicao de laser induziu a proliferao celular, comprovando ser um modelo vivel. O mesmo no podemos dizer do modelo com condio de dficit nutricional total (sem SFB) uma vez que a maioria das clulas em todos os grupos estavam mortas aps 4 dias do incio do experimento.

Quando observamos as curvas de crescimento dos grupos irradiados com concentrao de 5% de soro fetal bovino irradiados verificamos que esses grupos atingiram o mesmo nmero de clulas que os grupos controle em meio com 10% de soro fetal bovino, sobretudo aps 96 horas, que era o crescimento normal. Este aumento pode ter sido induzido pela produo de fatores autcrinos de crescimento, que so fatores que a prpria clula sintetiza e que age sobre ela mesma (ALBERTS et al.,1989). O que ratifica que o laser de baixa potncia atua como potencializador das funes celulares quando em condies adversas. Nos grupos sem soro fetal bovino os controles no apresentaram crescimento algum enquanto que os irradiados apresentaram crescimento significativamente maior, provavelmente porque a proliferao celular induzida pelo laser produziu a reposio de fatores de crescimento no meio de cultura.

Tendo em vista que as clulas utilizadas apresentam praticamente a mesma absoro para os dois lasers emitindo radiao nos comprimentos de onda de 670 nm e 692 nm (apndices 2.a e 2.b), podemos considerar que os resultados obtidos na faixa do visvel dependeram fundamentalmente das variaes da fluncia e irradincia a que foram submetidas as amostras. Esta assertiva tambm vlida para os lasers emitindo radiao em 780 nm e 786 nm, uma vez que a absoro destes comprimentos de onda pelas clulas tambm praticamente o mesmo (apndices 2.a e 2.b).

Analisando a curva de crescimento da figura 5.11 (mesma fluncia e irradincia), temos que o laser emitindo radiao em 692 nm, induziu maior proliferao celular que o laser emitindo em 786 nm. Comparando o resultado acima com o da figura 5.6 podemos observar que no segundo caso o melhor efeito foi obtido com o laser emitindo na regio do infravermelho, levando-nos a inferir que tempos de exposio radiao muito longos podem levar as clulas em cultura a uma condio de estresse.

Pudemos observar uma tendncia ao alinhamento dos fibroblastos dos grupos irradiados (Fig. 5.4), j citado na literatura por ENWEMEKA et al. em 1990, e inferido pelo trabalho de TANG et al., em 1997. Poderia ser ainda uma das explicaes da qualidade esttica superior das cicatrizes formadas clinicamente nos pacientes submetidos a essa terapia.

6.3. Discusso Final

Em linhas gerais so numerosos os estudos que se vm realizando sobre a ao do laser de baixa potncia na cicatrizao de tecidos e reparao de feridas, principalmente enfocando leses cutneas, sobretudo aquelas relacionadas prtica mdica (lceras, queimaduras, feridas cirrgicas) onde se demonstra acelerao e melhora esttica das leses tratadas. Entretanto, observa-se uma escassez de trabalhos cientficos em leses superficiais de mucosa, e estudos in vitro utilizando fibroblastos de mucosa, talvez devido ao fato de que no exista uma casustica clnica muito extensa, ou a que as complicaes do tipo cicatricial no sejam to freqentes ou to graves em odontologia como em dermatologia ou outras especialidades mdicas. De qualquer forma, em odontologia existem leses na mucosa oral, sobretudo aquelas que se apresentam aps cirurgias extensas de pacientes imunodeprimidos, sendo a infeco a mais grave delas. Como se observou nos estudos clnicos, existe uma ao teraputica do laser de baixa potncia muito significativa sobretudo na acelerao e qualidade da cicatrizao conforme demonstraram diversos resultados encontrados na literatura. A acelerao da cicatrizao tecidual fica justificada por resultados obtidos por trabalhos de autores como ABERGEL et al., 1986; POURREAU-SCHNEIDER et al., 1990; TSUCHIDA et al., 1991; VAN BREUGEL et al., 1992; BOLTON et al., 1992; KUSAKARI et al., 1992; NOGUEROL et al., 1994) e outros autores que demonstraram aumento da capacidade mittica celular e incremento na proliferao de fibroblastos bem como incremento da sntese de colgeno (ABERGEL et al., 1986; LAM et. al., 1989; ENWEMEKA et al., 1990; KERT e ROSE, 1989; HUBACEK et al., 1991; SKINNER et al., 1996). Igualmente TRELLES e MESTER, 1984; KAMEYA et al., 1995; WEI YU et al., 1997a e REDDY, et al., 1998, indicaram que a radiao laser favorece a formao precoce de tecido de granulao bem como da vascularizao local (KUBOTA e OHSHIRO, 1989; MAIER et al., 1990, WEI YU et al., 1997a).

Portanto, vista da bibliografia compulsada, parece ser um princpio fundamental aplicar-se o laser de baixa potncia nas primeiras 24 horas aps a injria, pois nessa fase que se observa, nas reas irradiadas, uma maior afluncia de elementos defensivos e um elevado nmero de mitoses das clulas do estrato germinativo. Tudo isso provocar a retirada precoce de detritos tissulares da leso, favorecendo a formao de tecido de granulao nas sesses seguintes irradiao e, em conseqncia, acelerao do processo de cicatrizao, como se evidencia nos resultados macroscpicos relatados na literatura. Observamos que naqueles trabalhos onde a irradiao com laser foi realizada alguns dias aps a injria, no foi observada alterao significativa do tempo do processo cicatricial (SMITH et al., 1992).

Por outro lado, o nmero de brotos vasculares encontrados nas reas de mucosa irradiada aumenta a reabsoro de restos celulares e aporte de elementos de defesa, contribuindo tambm para a acelerao do processo cicatricial das leses, como indicam EL SAYAD e DYSON, 1990; VAN BREUGEL e BR, 1992; LUBART et al., 1997; WEBB et al., 1998.

Sabemos ainda que a infeco constitui talvez o motivo mais importante do atraso e inclusive do fracasso na cicatrizao de feridas, queimaduras, lceras, entre outras leses, motivo pelo qual se presta especial ateno administrao de antibioticoterapia preventiva nesses pacientes. Observamos nos dados da literatura que o laser tem ainda uma ao direta que favorece a preveno de infeco em nvel local (LIEVENS, 1991; FILONENKO, 1995; GMEZ-VILLAMANDOS et al., 1997; SASAKI e OHSHIRO , 1997). Esta ao deve-se a vrios fatores, entre eles sua ao sobre a microcirculao local, originando maior aporte sangneo na regio irradiada com conseqente aumento de elementos defensivos humorais, assim como efeito sobre o trofismo local que provoca um incremento na capacidade fagocitria pelo aumento de macrfagos na zona afetada (HUBACEK et al., 1985; KARU et al., 1989; YOUNG et al., 1989; SILVEIRA et al., 1991).

Como concluso, estes trabalhos evidenciaram claro efeito teraputico nas leses irradiadas com laser, efeito que se traduziu em cicatrizao antecipada e ausncia de sinais de infeco, tanto microscopicamente como macroscopicamente.

Nossos resultados substanciam esta ao e sugerem que, em fibroblastos de mucosa oral, a ao se dar da mesma maneira. Por outro lado, levam-nos a inferir que pacientes com algum comprometimento do processo de reparao so os que devero ter maior benefcio quando submetidos a esse tipo de terapia.

O laser de baixa potncia possibilita um tratamento fcil e de baixo custo, podendo substituir ou complementar diversas terapias tanto na clnica mdica como na odontolgica.

Apesar de diversos trabalhos corroborarem o efeito bioestimulador do laser de baixa potncia, so necessrias mais pesquisas e comprovaes clnicas com a finalidade de determinar suas aes sobre a particularidade de cada quadro patolgico. Faz-se tambm necessrio uma padronizao rigorosa quanto variao de parmetros de irradiao tais como comprimento de onda, fluncia, irradincia e nmero de sesses de aplicao de forma a obter-se resultados reproduzveis.



 

7. Concluses
 

Para fibroblastos de gengiva humana em cultura podemos concluir que:

  1. O cultivo primrio com aspecto fibroblstico pode ser obtido a partir de fragmentos de gengiva humana normal, obtendo-se linhagem estvel.
  2. A utilizao de concentrao de 5% de soro fetal bovino mostrou ser um modelo ideal para a anlise da ao dos lasers operando em baixa potncia, porque o crescimento celular diminui proporcionalmente concentrao de soro fetal bovino.
  3. A fluncia administrada, 2 J/cm2, estimula o crescimento de fibroblastos de gengiva humana que estejam em dficit nutricional.
  4. O efeito dos laseres em fibroblastos in vitro que estejam em estado de dficit nutricional absoluto (sem SFB) est limitado manuteno do nmero de clulas viveis inicial; foi verificada a existncia do efeito estimulativo do laser de baixa potncia na proliferao de fibroblastos in vitro que estejam em estado de dficit nutricional (com 5% de SFB); o efeito estimulativo dos laseres na proliferao de fibroblastos in vitro que estejam em condies ideais de crescimento (com 10% de SFB), com a fluncia ora adminsitrada, baixo e no significativo.
  5. Experimentos com comprimento de onda operando em 670 nm revelaram que o tempo de exposio da clula radiao laser pode determinar a resposta celular, sendo que menor tempo de irradiao mostrou ser mais eficaz na induo da proliferao celular. Para irradiaes de clulas em cultivo com parmetros idnticos (mesma fluncia e irradincia), evidenciamos proliferao celular tanto para comprimento de onda no visvel como no infravermelho prximo, com resultados mais efetivos para o primeiro caso.


 

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Abreviaturas

A: Angstrm
As-Ga: Arsenieto de glio
As-Ga-Al: Arsenieto de glio-alumnio
ATP: Adenosina-trifosfato
ADP: Adenosina-difosfato
C: Centgrado
cl: Clula
cels: Clulas
cm: Centmetro
cm2: Centmetro quadrado
l: Comprimento de onda
CO2: Dixido de carbono
DE: Densidade de Energia
DP: Densidade de Potncia
DME: Eagle modificado por Dulbecco
DMSO: Di-metil sulfxido
DNA: cido desoxirribonuclico
EDTA: Ethylenediamine-tetraacetic acid = cido etilenodiamino tetraactico
EGF: Epidermal Growth Factor = Fator de crescimento epidrmico
EGF-R: Receptor de EGF
f: Freqncia
FAF: Fibroblast Activating Factor = Fator ativador de fibroblasto
aFGF: Acid Fibroblast Growth Factor = Fator de crescimento cido do fibroblasto
bFGF: Basic Fibroblast Growth Factor = Fator de crescimento bsico do fibroblasto
FGF-R: Receptor de FGF
F: Dimetro do feixe laser
g: Grama
Ga: Glio
h: Horas
He-Cd: Hlio Cdmio
HeLa: Clulas de linhagem HeLa
He-Ne: Hlio Nenio
Hz: Hertz
IGF I: Insulin-like Growth Factor = Fator de crescimento semelhante insulina I
IGF II: Insulin-like Growth Factor = Fator de crescimento semelhante insulina II
IL-1: Interleukin-1 = Interleucina-1
IL-6: Interleukin-6 = Interleucina-6
IL-8: Interleukin-8 = Interleucina-8
J: Joules
Kg: Kilograma
m: Metro
M: Mol
mg: Miligramo
min: Minutos
mks: Sistema metro-kilogramo-segundo
ml: Mililitro
ml: Microlitros
mm: Milmetro
mM: Milimol
m/s: Minutos por segundo
mrad: Miliradiano
mW: Miliwatts
mm: Micrmetro
N2: Nitrognio
nm: Nanmetros
O2: Oxignio
P: Potncia
PBSA: Phosphate Buffer Saline = Soluo tampo fosfato-salina sem clcio e magnsio
pH: Potencial hidrogeninico
PM: Peso molecular
RNA: cido ribonuclico
RNAm: cido ribonuclico mensageiro
s: Segundo
SFB: Soro fetal bovino
TEM: Transversal Eletromagnetic Mode = Modo eletromagntico transversal
TEMoo: Gaussian Laser Beam = Raio laser gaussiano
TGFa : Transforming Growth Factor alfa = Fator de crescimento transformante alfa
TGFb : Transforming Growth Factor beta = Fator de crescimento transformante beta
TNF-a : Tumor Necrosis Factor-alfa = Fator de necrose tumoral-alfa
W: Watts
C: Graus Celsius
x 100 = Aumento de 100 vezes
x 200 = Aumento de 200 vezes
 
 

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