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diagnóstico e laboratório

Otimização do método de detecção do gene PML-RARa para PCR quantitativo

28/05/2008

Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

 

Resumo

VASCONCELLOS, Jaíra Ferreira de, MELO, Raul Antônio Morais, MELO, Fárida Coeli Barros Correia et al. Otimização do método de detecção do gene PML-RARa para PCR quantitativo. J. Bras. Patol. Med. Lab., fev. 2008, vol.44, no.1, p.7-10. ISSN 1676-2444.

O gene híbrido PML-RARa é o marcador molecular presente na maioria dos casos de leucemia aguda promielocítica (LAP), sendo útil ao diagnóstico e ao estudo da doença residual mínima. A técnica molecular empregada como rotina laboratorial é a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) qualitativa, porém com o surgimento da PCR em tempo real (Q-PCR), foram descritas abordagens de detecção do gene PML-RARa possibilitando a quantificação de transcritos, com a vantagem metodológica da eliminação do processamento pós-PCR. No entanto, os protocolos relatam o uso de sondas fluorescentes de custo elevado para a rotina clínica, limitando sua aplicação. Este estudo teve como objetivo otimizar o método de detecção do gene PML-RARa para Q-PCR, utilizando como sistema de marcação fluorescente o intercalante SYBR® Green. A análise foi realizada com cDNA da linhagem celular NB4, tendo sido testados protocolos de termociclagem, síntese de cDNA com primer randômico ou específico e diferentes concentrações de MgCl2 e primers para amplificação. Os resultados mostraram amplificação mais eficiente nas seguintes condições: 2 mM MgCl2, 10 pmol de primers e cDNA sintetizado com primer específico. Não houve diferença na utilização de etapas para anelamento (58°C/30 s) seguido de extensão (72°C/30 s) ou etapa única de anelamento associado à extensão (60°C/45 s). Esses resultados demonstram a otimização da detecção do gene PML-RARa para Q-PCR através de um método considerado sensível e de baixo custo para a rotina laboratorial.

Palavras-chave : LAP; PML-RARa; Q-PCR; SYBR® Green.

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http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S1676-24442008000100003&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt

 

 


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